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胶质母细胞瘤是一种预后极差的高度恶性颅内肿瘤。血管内皮生长因子(VEGF)过度表达,同时抑癌蛋白PTEN功能缺失是该肿瘤的两个重要特征。目前,肿瘤的联合治疗可以通过抑制不同的细胞信号通路进而克服肿瘤的药物耐受性,因而成为一种很有前景的治疗策略。在本课题中,我们构建了pRetro-on-PTEN和pRNATU6.1/Neo-VEGF siRNA载体,研究野生型PTEN蛋白重建联合VEGF siRNA对人神经胶质瘤细胞U251增殖的抑制作用及对其致瘤性的影响。结果如下：1)重组载体构建与稳定转染细胞系建立的结果。将人工合成的针对VEGFmRNA的siRNA寡核苷酸片段,插入到pRNATU6.1/Neo质粒中,同时将PTEN蛋白的cDNA序列构建到四环素调控型的反转录病毒载体pRetro-on中,经酶切和测序鉴定重组载体构建正确。重组载体在脂质体LipofectaminTM 2000的介导下转染U251细胞。反转录病毒载体将PTEN蛋白的cDNA序列随机整合到U251细胞的基因组中,建立了以lug/mL强力霉素诱导表达的PTEN稳转细胞系。pRNATU6.1/Neo-VEGF siRNA质粒载体转染上述PTEN稳转的U251细胞后建立了PTEN与shRNA共表达的双稳转细胞系。2) VEGF siRNA干涉效率和PTEN诱导表达的结果。瞬时转染后48h,实时定量real-time PCR检测发现,与对照组相比,细胞中VEGF的mRNA水平下降了58.5%；ELISA分析显示,转染VEGF siRNA后,培养基中VEGF的分泌量明显降低,表明VEGF siRNA基因敲除效率显著。强力霉素处理PTEN稳转细胞48h,western blot检测PTEN的表达表明,PTEN蛋白成功得到诱导表达。3) PTEN重建与VEGF基因敲除对细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡影响的结果。Western blot检测发现,PTEN诱导表达后,AKT的磷酸化水平显著下降,然而在VEGF siRNA表达组中,AKT的磷酸化水平变化并不明显。MTT实验与AKT磷酸化水平相一致,PTEN诱导组而非VEGF shRNA瞬时转染组显著抑制U251细胞的增殖；流式细胞仪分析对细胞周期和细胞凋亡情况表明,PTEN重建能够显著地增加G0/G1期细胞的比份,但VEGF shRNA的转染并未对U251细胞的周期造成明显的影响。这表明,PTEN重建能够抑制U251细胞的增殖,将细胞周期阻滞在G0/G1期,促进细胞的凋亡。4) PTEN重建与VEGF基因敲除对细胞克隆形成与迁移能力的影响。软琼脂克隆形成实验与伤口愈合实验发现,瞬时转染的VEGF siRNA虽然不能抑制U251细胞的增殖和细胞周期进程,但在稳定转染细胞中却能够有效地抑制锚定不依赖性克隆形成能力和细胞迁移能力,而且,PTEN联合VEGF siRNA实验组抑制作用更明显。5)在体内肿瘤模型实验中,PTEN诱导组和VEGF siRNA组都能显著抑制U251细胞的增殖,并且在联合治疗组中没有观察到明显的瘤体组织。综上所述,野生型PTEN重建联合VEGF siRNA证实是一种有效的人神经胶质瘤治疗方案。