论文部分内容阅读
目的:神经系统是机体内对生理功能活动调节起主导作用的系统,主要由神经组织构成。而神经组织由神经细胞和神经胶质细胞组成,神经细胞又称神经元,是神经系统结构和功能基本单位。神经元数量庞大,它们具有接受刺激、传导冲动和整合信息的能力,同时具有内分泌功能。然而,神经组织受到损伤后,神经细胞难以再生。因此,神经系统疾病的再生修复治疗成为临床疾病治疗中的难点之一。牙龈作为口腔牙周支持组织之一,其位置表浅,取材方便,修复能力极强。有研究表明,牙龈成纤维细胞具有分化为其他组织细胞,如血管内皮样细胞,血管平滑肌样细胞和骨骼肌样细胞的潜能。本实验拟将牙龈成纤维细胞诱导分化为神经样细胞,探讨做为组织细胞的牙龈成纤维细胞向神经样细胞方向分化的可能性,为神经元的再生提供新的细胞来源。方法:1.人牙龈成纤维细胞的分离培养收集河北医科大学口腔医院口腔颌面外科阻生齿拔除后切除的正常牙龈组织,采用原代培养中组织块贴壁法培养牙龈成纤维细胞。培养液选取含双抗的15%胎牛血清低糖DMEM,0.25%胰酶消化传代。2.人牙龈成纤维细胞的鉴定成纤维细胞传至第4代,细胞爬片后固定。采用鼠抗人波形蛋白(vimentin)单克隆抗体,进行免疫细胞化学鉴定,同时采用鼠抗人胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acid protein GFAP)单克隆抗体和鼠抗人微管相关蛋白(Microtubule-associated protein-2,MAP-2)单克隆抗体做为阴性对照鉴定。3.人牙龈成纤维细胞诱导为神经样细胞取第4代对数生长期的人牙龈成纤维细胞进行诱导。采用含15%胎牛血清的低糖DMEM,其中添加1mmol/L?巯基乙醇(?-ME),20μmol/L维甲酸(RA),2%二甲基亚砜(DMSO),连续诱导12d观察。4.神经样细胞的鉴定采用鼠抗人vimentin单克隆抗体,GFAP单克隆抗体和MAP-2单克隆抗体对诱导后的神经样细胞进行免疫细胞化学染色。采用鼠抗人GFAP和MAP-2单克隆抗体进行免疫荧光化学鉴定。5酶联免疫吸附剂测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)实验检测神经样细胞的分泌功能及含量分别留取成纤维细胞和诱导后神经样细胞培养液,记为对照组和诱导组。应用ELISA法检测神经样细胞分泌的神经递质种类及含量。同时收集两组(对照组和诱导组)数据,所得结果用(?)±S表示,采用统计学中配对t检验的方法对两组数据进行统计学处理,并且绘制条图,得出P值,用P<0.05表示差异具有统计学意义。最后计算测得神经递质浓度含量。结果:1.人牙龈成纤维细胞的分离培养牙龈组织块培养7-9d,组织块周围有细胞爬出,细胞呈长梭形,旋涡状生长,细胞体及胞核大,核呈圆形或椭圆形,有2-3个核仁。2.人牙龈成纤维细胞的鉴定采用第4代人牙龈成纤维细胞做免疫细胞化学鉴定。结果显示,成纤维细胞抗vimentin呈阳性,胞浆被染成棕黄色,抗GFAP和MAP-2呈阴性,胞浆未被染成棕黄色。3.诱导人牙龈成纤维细胞为神经样细胞取第4代对数生长期的人牙龈成纤维细胞,用诱导液诱导12d后,可见多数细胞胞体由长梭形变为三角形或者多角形,突起变细变长,大多数为三极。突起之间互相连接成网状。4.神经样细胞的鉴定将诱导12d后的神经样细胞进行免疫细胞化学反应和免疫荧光化学反应。免疫细胞化学结果显示,神经样细胞抗GFAP呈阳性,抗MAP-2呈阳性,抗vimentin呈阳性。免疫荧光化学结果显示,神经样细胞抗GFAP和MAP-2均呈阳性。5.ElISA结果显示,神经样细胞分泌的神经递质为多巴胺和乙酰胆碱。诱导组和对照组中乙酰胆碱和多巴胺的含量差异具有统计学意义(P<0.05)。其中乙酰胆碱(Acetylcholine,Ach)的浓度大约为75 pg/ml,多巴胺(Dopamine,DA)的浓度大约为56.25 pg/ml。结论:1.人牙龈成纤维细胞能够诱导分化为神经样细胞。2.诱导形成的神经样细胞可以分泌神经递质乙酰胆碱和多巴胺。