论文部分内容阅读
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种猪的急性并高度接触性传染病,PEDV感染后可导致水样腹泻、呕吐、脱水等症状,成年猪很少表现出临床症状。从1976年开始我国就陆续有PED的报道,自2010年下半年以来,该病的流行强度和流行区域在不断的加强和扩大,对哺乳仔猪致死率较高,临床上与猪传染性胃肠炎、轮状病毒和大肠杆菌等疫病较难鉴别诊断,给世界养猪业造成了巨大经济损失。本研究将纯化的猪流行性腹泻病毒和N蛋白作为包被抗原,建立了间接ELISA方法,用于PEDV抗体的检测和血清学调查。此外,利用原核表达系统表达获得重组蛋白Nsp2,将纯化的Nsp2蛋白免疫小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备Nsp2蛋白的单克隆抗体,为PEDV诊断和致病机理的研究奠定基础。具体内容如下：1.PEDV全病毒抗原间接ELISA检测方法的建立与初步应用采用差速离心方法获得纯化PEDV,作为包被抗原,建立间接ELISA抗体检测方法,对各项反应条件进行优化,并确定其临界值,同时进行特异性、敏感性、重复性及符合率试验,优化反应条件为：抗原包被浓度为3μg/ml,包被时间为37℃作用2h,1.5%BSA37℃封闭3h,待检血清样品稀释度为1：100,作用时间为1h,酶标SPA1：10,000稀释,37℃作用30min,抗体临界值为OD450nm≥0.306判为阳性,OD450nm≤0.268判为阴性,介于二者之间为可疑。该方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟、猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒血清抗体均为阴性,批间和批内重复性试验较好,对江苏、上海、浙江、安徽地区587份猪血清样品进行检测,抗体阳性率达60.31%,与TSZ公司的PEDV抗体检测试剂盒比较,其符合率为91.3%、证明该方法具有较好敏感性、特异性、重复性及符合率,可用于PEDV抗体检测和流行病学调查。2. PEDVN蛋白间接ELISA检测方法的建立与初步应用将PEDV N蛋白基因克隆至大肠杆菌表达载体,表达获得重组N蛋白,SDS-PAGE和Western-blot鉴定结果显示,该蛋白分子量大小为55KDa,具有良好的反应原性和特异性。采用亲和层析纯化获得纯化重组N蛋白,作为包被抗原,建立间接ELISA抗体检测方法,优化反应条件为：抗原最佳包被浓度为0.8μg/ml,血清样品最佳稀释度为1：100,包被时间为37℃作用2h后4℃过夜,1%BSA37-C封闭3h,待检血清作用时间为1h,酶标SPA1：15,000稀释,37℃作用45min,抗体临界值为OD450nm芝0.312判为阳性,OD450nm≤0.265判为阴性,介于二者之间为可疑。该方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟、猪伪狂犬病毒和口蹄疫病毒血清抗体均为阴性,批间和批内重复试验变异系数为2.6%-9.3%。对江苏、上海、浙江、安徽地区458份猪血清样品进行检测,抗体阳性率达69.21%。与TSZ公司的PEDV抗体检测试剂盒比较,其符合率为89.13%；与建立的猪流行性腹泻全病毒抗原间接ELISA抗体检测方法进行符合率比较,符合率为90%,证明该间接ELISA方法可以为PEDV诊断和流行病学调查提供依据。3. PEDVNsp2基因原核表达与纯化及单克隆抗体的制备为表达PEDV非结构蛋白Nsp2,本研究采用PCR方法从PEDV阳性组织病料中扩增Nsp2基因,,将其克隆至pET-32a载体,将鉴定正确的重组质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导、SDS-PAGE和Western blot鉴定,获得重组蛋白Nsp2大小约50KD。成功构建了重组表达质粒pET-32a-Nsp2,并应用亲和层析方法纯化了重组Nsp2蛋白；以纯化的PEDV Nsp2蛋白免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术进行融合,通过间接ELISA方法进行筛选,获得了1株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为6B6。测其细胞上清效价为1：3,200,腹水效价为1：2.048×105；Western-blot鉴定表明获得6B6单克隆抗体能够与原核表达的Nsp2蛋白反应.综上所述,本研究利用猪流行性腹泻病毒纯化全病毒抗原和重组蛋白N,成功建立了间接ELISA抗体检测方法,同时制备了PEDV Nsp2蛋白的单克隆抗体,为PEDV血清学诊断、免疫抗体检测及流行病学调查提供了简便、快速的检测手段；也为Nsp2蛋白结构与功能的进一步研究奠定了基础。