缓解氧化应激乳酸菌的筛选、表征和功能评价研究

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氧化应激与损伤是机体系统性和代谢性疾病发生发展的重要生理和病理过程,已成为药物发现和功能性食品开发常用的作用靶点和研究模型。基于营养调控的膳食干预方案是机体氧化应激的一种有效控制策略。研究表明,乳酸菌可能具有缓解不同因素导致氧化应激的潜力。筛选与挖掘具有突出缓解氧化应激能力的乳酸菌,探讨乳酸菌对氧化应激的干预作用,开发针对氧化还原失衡和氧化应激损伤的基于肠道微生态调节的功能性乳酸菌菌株及相关产品,具有重要的理论研究意义和实践应用价值。本论文在综述乳酸菌干预氧化应激研究进展的基础上,开展具有体外抗氧化能力的乳酸菌的筛选研究,对乳酸菌对高脂膳食和铅暴露导致氧化应激的干预作用进行分析和评价研究,并探讨其可能的作用机制,最后对具有突出缓解氧化应激能力的乳酸菌的微生物学性质和食品生物加工应用基础进行研究。论文取得研究结果如下。1.具有优良体外抗氧化能力乳酸菌的筛选与鉴定利用PCR-DGGE分子微生态调查的方法分析了中国传统自然发酵蔬菜的细菌菌相组成,在中国传统自然发酵蔬菜中存在明串珠菌、植物乳杆菌、弯曲乳杆菌、清酒乳杆菌、乳酸乳球菌和魏斯氏菌等细菌种类。以耐酸和耐胆盐为指标筛选得到了一些具有耐酸和耐胆盐能力的乳酸菌;开发了一种利用体外过氧化氢氧化胁迫模型筛选具有体外抗氧化能力乳酸菌的初筛和复筛方法,以含过氧化氢的三层MRS平板为初筛方法,以在过氧化氢溶液中的存活能力为复筛指标,从现有耐酸耐胆盐乳酸菌分离物、发酵食品和健康婴儿个体粪便中筛选得到了一些具有显著体外抗氧化能力的乳酸菌。在此基础上,以还原活性高低、抑制脂质过氧化能力、DPPH和羟自由基清除能力、亚铁离子和铜离子螯合性能等体外抗氧化能力评价指标评价了乳酸菌分离物的体外抗氧化性能。分离物CCFM8661和CCFM1566的还原力分别达到了226.47±4.68、212.35±6.45μmol/L半胱氨酸当量。在脂质体体系中不同测试乳酸菌菌株对脂质过氧化的IC50值在8.1-9.3Log10(cfu/mL)之间,其中对脂质体脂质过氧化抑制能力最强的菌株是CCFM8661(IC50=8.1Log10(cfu/mL))。在1010cfu/mL细胞浓度水平下,对DPPH自由基和羟基自由基清除效果较好的菌株有CCFM1106、CCFM8661、CCFM1566和ATCC53103菌株。测试的乳酸菌分离物对亚铁离子的螯合量在9.8-48.7mg/kg之间,对铜离子的螯合量在16.3-42.6mg/kg之间。CCFM8661、CCFM1566和ATCC53103菌株具有较高的亚铁离子和铜离子螯合能力。综合不同体外抗氧化能力指标确定了2株具有优良体外抗氧化能力的乳酸菌,鉴定为植物乳杆菌CCFM8661和干酪乳杆菌CCFM1566,均保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。2.乳酸菌对高脂膳食诱导小鼠氧化应激的缓解作用利用高脂膳食饲喂小鼠诱导氧化应激模型评价了植物乳杆菌CCFM8661和干酪乳杆菌CCFM1566在体内缓解高脂膳食诱导的氧化应激的能力。研究结果表明,植物乳杆菌CCFM8661、干酪乳杆菌CCFM1566和ATCC53103能缓解高脂膳食诱导的在模型小鼠血液和肝脏中产生的氧化应激,缓和效果与饲喂剂量之间存在一定的量效关系。高脂膳食摄入引起模型小鼠肠道菌群发生改变,肠杆菌、肠球菌类和产气荚膜梭菌的水平显著升高(P<0.05),而有益菌乳杆菌和双歧杆菌的水平呈现显著下降(P<0.05)。摄入植物乳杆菌CCFM8661和干酪乳杆菌CCFM1566能有效逆转高脂膳食饲喂小鼠的肠道菌群变化。同时,饲喂植物乳杆菌CCFM8661和干酪乳杆菌CCFM1566能显著降低(P<0.05)高脂膳食诱导氧化应激模型小鼠血浆内毒素的水平。3.对铅具有耐受和吸附能力的乳酸菌的筛选和表征利用体外耐受实验和吸附实验研究了不同乳酸菌对铅的耐受能力与吸附能力,分析了植物乳杆菌CCFM8661对铅的吸附特性和规律。研究结果表明,在所测试的菌株中对铅的耐受具有菌株特异性,其中植物乳杆菌CCFM8661对铅的耐受能力最强,在150mg/L铅浓度水平下仍然能很好地生长。吸附能力实验表明,在所有测试菌株中植物乳杆菌CCFM8661的对铅的吸附能力最强,达到了49.55mg/g干菌重(活菌体)及53.02mg/g干菌重(死菌体)。吸附特性和规律研究表明,pH对吸附影响较大,CCFM8661对铅离子的吸附能力随着铅溶液中初始pH的增大而增大,在pH为6.0-7.0时达到最大吸附值,当体系pH<2时,CCFM8661对铅离子的吸附能力很低,几乎不吸附;CCFM8661对铅离子的吸附作用随着初始铅离子浓度的增大而增大,满足朗谬尔吸附等温线方程,理论最大铅吸附量为103.9mg/g。当初始菌量增加时,吸附率升高,但单位质量菌体的吸附能力下降。吸附过程分析表明,CCFM8661对铅的吸附是一个较为快速的过程,在2h时已基本达到最大吸附水平。4.植物乳杆菌CCFM8661对铅暴露诱导氧化应激和铅毒性的缓解作用利用铅暴露染毒模型小鼠研究了膳食饲喂植物乳杆菌CCFM8661及不同饲喂干预方式对铅暴露诱导氧化应激和毒性的缓解作用。相比于铅暴露造模组小鼠,饲喂植物乳杆菌CCFM8661(细胞浓度1.0×109cfu/mL,灌胃0.5mL/d)能显著降低治疗组与干预组小鼠血液和肾组织的铅水平(P<0.05),饲喂植物乳杆菌CCFM8661对铅暴露小鼠具有突出的排铅效果。植物乳杆菌CCFM8661还能恢复由于铅暴露而受到抑制的靶点酶δ-氨基乙酰丙酸脱水酶活性,从而避免铅暴露导致的血红素合成抑制。此外,植物乳杆菌CCFM8661能降低小鼠体内由铅暴露而提高的活性氧水平,并能通过改善超氧化物歧化酶活性,提高还原型谷胱甘肽水平来恢复被铅暴露破坏的抗氧化防御系统。就植物乳杆菌CCFM8661的饲喂干预方式而言,干预组(在小鼠铅暴露同时饲喂CCFM8661)比治疗组(在小鼠铅暴露停止之后饲喂CCFM8661)更有效;菌体活性对两种干预方式的靶点酶活性抑制的逆转和氧化应激的缓解效果影响差别不大。植物乳杆菌CCFM8661在促排铅效果上低于铅中毒治疗药物DMSA,但CCFM8661在恢复靶点酶活力、清除活性氧、改善超氧化物歧化酶活性及提升还原型谷胱甘肽等方面能更有效地缓解铅导致的氧化应激。5.植物乳杆菌CCFM8661的微生物学性质和应用基础研究植物乳杆菌CCFM8661是一株嗜温性乳酸菌,最适生长温度在32℃,生长温度范围在10-42℃;最适起始生长pH在6.5,起始生长pH范围在3.5-8.5。在液体MRS培养基中在32℃条件下,CCFM8661的生长符合Boltzmann对数增长模型,在0.1%(V/V)接种量时,经培养6h进入对数增长期,培养18小时进入稳定期,最大活菌浓度达4.8×109cfu/mL。在复原脱脂乳中,CCFM8661生长缓慢,在0.1%接种量条件下,在不含糖的复原脱脂乳中菌数仅增加了约1个对数周期,添加葡萄糖时菌数增加了2Log10(cfu/mL)。牛乳不是适合植物乳杆菌CCFM8661生长的介质。L. plantarum CCFM8661能耐受的最高食盐浓度为8.5%(W/W),耐受的最高胆盐水平为0.3%(测定基质MRS培养基)。经人工胃液处理2h后菌数约下降0.6Log10(cfu/mL),经人工肠液处理2h菌数约下降0.2Log10(cfu/mL),CCFM8661对人工胃液和人工肠液具有良好的耐受性。植物乳杆菌CCFM8661表现出一定的自凝集能力,同时具有较高的与大肠杆菌的交互凝集力。CCFM8661细胞具有较高的疏水性和表面电荷。CCFM8661对HT29细胞的粘附量为1.8±0.3×106CFU/well,具有优良的体外细胞粘附能力。pH是影响CCFM8661在贮藏期间存活性能的一个重要因素,在pH4.0-6.0之间有着良好的存活稳定性,经过24天4℃低温保藏,活菌数仍然在106cfu/mL以上;CCFM8661可以作为补充发酵剂用于酸乳制作,对酸乳菌种的生长无抑制作用,同时对产品的理化指标和感官和质构指标无有害影响。植物乳杆菌CCFM8661在豆乳中生长和产酸良好,可以用作发酵剂用于酸豆乳的制作。
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