马传染性贫血(Equine infectious anemia,EIA)是一种能够感染马、驴和斑马等马属动物的动物性传染病。它能够引起马属动物贫血、血小板减少、发热、消瘦和多器官衰竭等症状。EIA由Ligné于1843年在法国首次发现,现已在美洲、欧洲、中东和南非等世界范围都有流行,使当地畜牧业,赛马业和相关产业遭受巨大经济损失。解放前期,我国也曾出现EIA流行,但在20世纪70-80年代由于沈荣显等人研制出EIAV弱毒疫苗,从而使疫病得到有效控制。马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)是引起EIA的病原体。EIAV属于反转录病毒科慢病毒,同其他慢病毒如人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)、猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus,SIV)和猫免疫缺陷病毒(Feline immunodeficiency virus)类似,EIAV包含有Gag、Pol和Env 3个主要的结构蛋白和Tat、Rev和S2 3个非结构蛋白。Gag蛋白作为多聚蛋白,最终可以剪切为基质蛋白(MA)、衣壳蛋白(CA)、核衣壳蛋白(NC)和p9蛋白,这些蛋白都作为病毒粒子结构的一部分而存在。EIAV衣壳蛋白又称为p26蛋白,它的主要功能是自我组装形成病毒的衣壳结构,其构成的拓扑学结构包裹EIAV的基因组以确保病毒的有效复制。同时作为病毒感染过程中的主要免疫原性蛋白,p26在不同EIAV株的结构与功能高度保守。并且p26蛋白也是病毒粒子中丰度最高的蛋白之一。本研究通过实验室制备的2株EIAV p26单克隆抗体:MAb 1G11和MAb 9H8,利用肽扫描技术,最终通过免疫印迹试验(western blot)鉴定出MAb 1G11和MAb 9H8所针对p26蛋白的线性表位。MAb 1G11针对p26蛋白C端的20个氨基酸:199KNAMRHLRPEDTLEEKMYAC218;MAb 9H8则针对N端的8个氨基酸:73NLDKIAEE80。这对于分析p26蛋白结构与功能以及以表位为基础建立诊断方法提供了依据,也对基于表位的疫苗设计具有指导意义。在国务院颁布的《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)》中,明确指出要对EIA开展持续监测,对经济娱乐用马以及高风险区域的马属动物进行重点监测,从而加快推进马传染性贫血消灭行动。根据生产实际和国家发展纲要,建立快速有效的诊断EIA的方法显得尤为迫切与重要。传统检测EIAV的方法是利用p26蛋白检测EIAV抗体的琼脂扩散试验(Agar gel immunodiffusion,AGID),又称为Coggins试验。尽管AGID在检测EIAV高度特异,但是缺乏敏感性。这对于检测处于慢性期和非明显期的临床症状的EIA感染尤为不利。同时只能通过肉眼观察抗原抗体结合的沉淀线粗细来对EIAV含量进行粗略判断,并无法对病毒进行定量分析。再次,由于试验周期较长,无法对疾病进行快速诊断,使得在生产实践无法对疫情做到及时有效防控。本研究所鉴定的线性表位分别针对p26蛋白的N端与C端。其所针对的差异表位特性,为本实验建立抗原捕获ELISA(Antigen Capture-ELISA,AC-ELISA)提供了可能。因此通过利用EIAV(CMV 3-8)感染性克隆或重组p26蛋白作为标准抗原,以MAb 1G11和MAb 9H8分别作为捕获抗体和酶标检测抗体,建立以检测EIAV的AC-ELISA方法。该方法也可以对病毒进行定量,这也为研究病毒复制与其他相关生活周期病毒含量变化,以及EIAV与宿主限制因子(host restriction factors)如TRIM5α,APOBEC3家族和Tetherin相互拮抗作用提供了定量分析平台。综上,本研究利用针对EIAV p26蛋白的两株单克隆抗体MAb 1G11和MAb 9H8,利用肽扫描技术鉴定出p26蛋白在蛋白N端与C端的线性表位;同时利用MAb 1G11和MAb 9H8识别p26蛋白表位的差异性,建立针对不同EIAV病毒株的AC-ELISA方法。已鉴定的线性表位可以为研究p26蛋白的结构与功能以及基于表位建立检测和设计表位疫苗提供依据;通过建立的AC-ELISA方法不仅可以应用于临床样品检测及相关生产实践应用,同时也可以通过病毒定量分析为深入研究病毒本身及病毒-宿主相互作用提供方法学平台。