目的:胰腺作为分泌胰岛素的最主要腺体,是人体内的重要消化器官,可以参与糖、脂肪、蛋白质等多种生命必需物质的代谢,是机体物质代谢系统的核心组成。当胰腺发生病变时,可以引起糖尿病、胰腺癌等胰腺相关疾病的发生。本文围绕糖尿病和胰腺癌这两个疾病将实验分为两个部分。糖尿病是由于胰岛素分泌减少所引起的一种以高血糖为特征的慢性代谢性疾病。据2019年末国际糖尿病联合会统计,全球共有约4.63亿糖尿病患者,其中中国糖尿病人数约为1.164亿人,居全世界首位。由于糖尿病所导致的高血糖、高游离脂肪酸可以加强氧化应激的发生,氧化应激又可以直接损伤β细胞导致胰岛素分泌减少,从而促进糖尿病的发生,因此,糖尿病与氧化应激是相互关联、相互影响的。SP是一种神经肽物质,其与胰腺相关病症关系密切,可以缓解胰岛炎症病变,使胰岛素敏感性增强。NK-1受体是SP的最主要受体,已经发现NK-1受体可在胰岛α细胞上表达,而在胰岛β细胞上不表达。GLP-1是一种可以由胰岛α细胞分泌的肽类物质,其可以通过与胰岛β细胞上的GLP-1受体结合从而在胰岛素的合成和分泌中发挥重要作用。本课题第一部分主要是通过构建氧化应激诱导的胰岛细胞损伤模型,结合离体胰腺灌流的实验,研究SP对胰腺的保护作用及其机制,为预防治疗糖尿病开辟新的道路。胰腺癌是高度恶化的肿瘤,胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）作为胰腺癌的一个病理类型,占胰腺癌的85%以上。由于PDAC发病较为隐匿,侵袭性极高,其治疗方面目前仍面临着巨大的挑战。人们迫切需要了解PDAC的分子病理学机制,鉴定关键信号传导途径,筛选新的治疗靶点。近年来,随着高通量测序技术的出现,为肿瘤生物标志物的筛选提供了便利条件。本课题第二部分主要是通过生物信息学分析来研究PDAC的潜在生物标记物和治疗靶点。方法:第一部分:1、SP对H₂O₂诱导的大鼠胰岛细胞氧化损伤的作用健康雄性SD大鼠,胆管注入胶原酶Ⅴ（1mg/mL）提取大鼠胰岛团进行培养。我们把实验分为三组:空白对照组、H₂O₂处理组、SP预处理后H₂O₂处理组,通过FDA/PI染色检测培养后的细胞活率;将培养后的胰岛团制备冰冻切片,用TUNEL试剂盒检测其细胞凋亡情况,免疫荧光染色检测胰岛素表达情况;将培养后的细胞上清液收集,用ELISA试剂盒来检测胰岛素分泌情况。2、SP对H₂O₂诱导的大鼠胰岛细胞氧化损伤保护作用的机制为了确定SP对H₂O₂诱导的大鼠胰岛细胞氧化损伤的保护作用是否是通过与NK-1受体的结合所引起的,我们使用NK-1受体阻滞剂进行进一步研究。我们把实验分为五组:空白对照组、H₂O₂处理组、SP预处理后H₂O₂处理组、SP伴NK-1受体阻滞剂预处理后H₂O₂处理组,NK-1受体阻滞剂预处理后H₂O₂处理组。通过FDA/PI染色检测细胞活率;用ELISA试剂盒来检测胰岛素、GLP-1分泌情况。由于NK-1受体是在胰岛α细胞上表达,在胰岛β细胞上不表达,而GLP-1受体在胰岛β细胞表达并且GLP-1可由α细胞分泌,为了进一步研究SP对H₂O₂诱导的大鼠胰岛细胞氧化损伤的作用是否与GLP-1有关,我们使用GLP-1受体阻滞剂进行进一步研究。我们把实验分为五组:空白对照组、H₂O₂处理组、SP预处理后H₂O₂处理组、SP伴GLP-1受体阻滞剂预处理后H₂O₂处理组,GLP-1受体阻滞剂预处理后H₂O₂处理组。之后通过FDA/PI染色检测细胞活率并用ELISA试剂盒来检测胰岛素分泌情况。3、SP对大鼠离体胰腺的影响分离胰腺,结扎胰腺周围血管,构建胰腺离体灌流模型,经腹主动脉依次灌注5.6 mmol/L葡萄糖溶液、不同浓度（10^-99 mol/L、10^-66 mol/L）的SP溶液,收集门静脉流出液,ELISA试剂盒对流出液中GLP-1的含量进行测定。对离体胰腺进行灌注5.6 mmol/L葡萄糖溶液或10^-66 mol/L的SP溶液后,提取胰腺组织匀浆液,ELISA试剂盒检测灌流后胰腺组织中GLP-1的含量。第二部分1、差异表达基因的筛选从GEO数据库筛选出三个mRNA表达谱GSE15471、GSE62165、GSE28735作为研究对象,均用GEO2R分析胰腺导管腺癌组织和正常胰腺组织之间的差异表达基因（DEGs）,调整后P值<0.05,|log2（fold-change）|≥1作为筛选的标准。使用维恩图对三个数据集上调或下调的DEGs分别取交集,筛选出共同上调或下调的DEGs。2、DEGs的功能分析使用DAVID在线数据库对DEGs进行基因本体论（GO）和KEGG富集分析,从而研究共同DEGs主要富集的生物学过程、分子功能、细胞组分以及分子信号通路。3、核心基因的筛选以及预后分析通过STRING数据库构建DEGs的PPI网络,并利用Cytoscape分析PPI网络中基因的连接度,从而筛选核心基因。使用Kaplan Meier-plotter在线软件进一步对核心基因进行生存分析以探讨核心基因对PDAC患者的预后意义。结果:第一部分1、SP对H₂O₂诱导的大鼠胰岛细胞氧化损伤的作用结果发现,与对照组相比,加入H₂O₂处理后,细胞活率明显下降（P<0.01）,细胞凋亡率明显增加（P<0.01）,胰岛细胞内胰岛素表达量明显下降（P<0.01）,胰岛素释放量明显减少（P<0.01）;而与H₂O₂组相比,给予SP处理可以导致胰岛细胞活率增加（P<0.01）,细胞凋亡率明显减少（P<0.01）,胰岛细胞内胰岛素表达量增加（P<0.01）,胰岛素释放量也增加（P<0.05）。以上结果都表明SP对H₂O₂诱导的大鼠胰岛细胞氧化损伤具有保护作用。2、SP对H₂O₂诱导的大鼠胰岛细胞氧化损伤保护作用的机制联合施用NK-1受体阻滞剂发现,SP对氧化应激胰岛细胞活力的保护作用在施用NK-1受体阻滞剂后被抑制（P<0.05）;SP对氧化应激胰岛细胞胰岛素释放量的促进作用也可以被NK-1受体阻滞剂抑制（P<0.05）。此外,使用ELISA试剂盒检测GLP-1含量发现,与对照组相比,H₂O₂处理可以减少胰岛分泌GLP-1（P<0.01）;SP则可以增加H₂O₂刺激下胰岛细胞GLP-1的分泌（P<0.05）;联合施用NK-1受体阻滞剂处理细胞可以引起SP组胰岛细胞分泌GLP-1含量下降（P<0.05）。以上结果表明SP对胰岛氧化应激损伤的保护作用是通过激活NK-1受体实现的,并且SP可以通过激活NK-1受体调节GLP-1的释放。联合施用GLP-1受体阻滞剂发现,SP对氧化应激胰岛细胞活力的保护作用在施用GLP-1受体阻滞剂后被抑制（P<0.01）;SP对氧化损伤胰岛细胞胰岛素释放量的促进作用在施用GLP-1受体阻滞剂后也可以被抑制（P<0.01）。以上结果表明SP对H₂O₂诱导的大鼠胰岛细胞氧化损伤保护作用与GLP-1的作用有关。3、SP对大鼠离体胰腺的影响与灌注5.6 mmol/L葡萄糖溶液的对照组相比,灌注不同浓度(10^-99 mol/L、10^-6mol/L)的SP溶液都可以使GLP-1分泌升高,差异均有统计学意义（P<0.05;P<0.01）。与仅灌流5.6 mmol/L葡萄糖溶液的对照组相比,灌流10^-66 mol/L SP溶液后,胰腺组织中GLP-1的含量发生增加,差异有统计学意义（P<0.01）。第二部分1、差异表达基因的筛选三个GEO数据集GSE15471、GSE62165、GSE28735中,我们分别得到1552、3750、412个DEGs,分别包括1374、2507、256个上调基因和178、1243、156个下调基因。对三组差异基因用维恩图取交集,结果显示,在所有DEGs中,共鉴定出170个共同上调的DEGs,54个共同下调的DEGs。2、DEGs的功能分析通过GO富集分析发现,224个DEGs参与的生物学过程主要有胶原分解代谢过程、细胞外基质分解、蛋白水解等;细胞组分主要富集于细胞外基质、蛋白质细胞外基质等;分子功能主要富集于丝氨酸型内肽酶活性、钙离子结合等。KEGG富集分析发现,DEGs主要富集于ECM-受体相互作用、粘着力、蛋白质消化吸收等通路。3、核心基因的筛选以及预后分析基于PPI网络中基因的连接度鉴定出十二个核心基因（COL1A1、COL3A1、COL5A2、COL6A3、FN1、ITGA2、MMP1、MMP9、TOP2A、ALB、EGF、POSTN）。Kaplan Meier-plotter分析12个核心基因的表达量与胰腺导管腺癌患者总生存率的关系,结果显示MMP1、MMP9、ITGA2、TOP2A、POSTN这五个核心基因的高表达与PDAC患者不良预后有关（P<0.05）。结论:1、SP对H₂O₂诱导的大鼠胰岛细胞氧化损伤具有保护作用,这种保护作用的机制为SP通过与α细胞上的NK-1受体结合,促进α细胞分泌GLP-1,GLP-1再通过与胰岛β细胞上的GLP-1受体结合,从而改善胰岛细胞的功能。2、本研究通过生物信息学分析发现5个核心基因MMP1、MMP9、ITGA2、TOP2A、POSTN可能作为PDAC新的预后标志物和PDAC的可行性治疗靶点。