研究背景与目的肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是世界上排名第五位的恶性肿瘤,并居于全世界癌症死因的第二位[1]。肝癌的高复发是造成肝癌患者高死亡率的主要原因,而术后的肝内微小转移被认为肝癌复发的主要原因[2,3]。上皮-间充质转变(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)就是肿瘤微转移和侵袭中的一个关键步骤,同时为肿瘤干细胞创造了适宜的微环境,促进肿瘤的发生、恶化、侵袭转移、耐药和复发。因此明确调控肝癌微转移的分子机制和肝癌干性细胞的生物学功能对于寻找新的治疗靶点及有效治疗药物具有深刻的理论价值和现实意义。本研究拟通过研究c PLA2α在肝癌肿瘤组织中的表达,以及与临床参数、病人预后的关系,探讨c PLA2α与肝癌侵袭转移的关系;通过体外细胞学实验和免疫缺陷小鼠移植瘤模型观察c PLA2α对肝癌细胞侵袭与转移能力的影响并对其影响机制进行研究;在此基础上探讨c PLA2α不同表达水平对肝癌上皮表型干细胞和间充质表型干细胞的影响,解析c PLA2α调控肝癌干细胞两种亚型之间相互转化的分子机制,探索其作为治疗肿瘤转移药物靶点的潜在可能性。方法1)免疫组化染色和新鲜冰冻组织Western Blot检测分析肝癌临床病例,探讨c PLA2α表达的临床病理意义及对预后的影响。2)选取肝癌HLE和Hep G2细胞为研究对象,利用慢病毒表达载体分别特异性降表达和过表达c PLA2α,建立c PLA2α不同表达水平的细胞模型。3)采用Matrigel体外侵袭实验、趋化运动实验、划痕实验实验探讨c PLA2α不同表达水平对肝癌细胞侵袭能力的影响;采用粘附实验观察c PLA2α不同表达水平下肝癌细胞对细胞外基质粘附能力的影响;分析c PLA2α降表达对肝癌细胞骨架蛋白F-actin的重构和聚合能力的影响。4)建立肝癌的免疫缺陷小鼠体内移植瘤模型,观察c PLA2α在体内对肝癌细胞成瘤能力、肿瘤侵袭能力的影响。5)采用细胞形态观察、Western Blot和细胞免疫荧光染色研究c PLA2α表达水平不同分别对EGF和TGFβ诱导的肝癌EMT发生的影响。6)通过Western Blot探讨c PLA2α不同表达水平分别对EGF和TGFβ诱导的PI3K/Akt信号通路的影响以及对EMT相关的转录因子snail,twist,ZEB1表达的影响,分析c PLA2α通过调控EMT的发生影响肝癌侵袭与转移的分子机制。7)采用无血清干性培养基富集培养肝癌干细胞球,分析c PLA2α不同表达水平的干细胞在形态上的差异。8)通过Western Blot、RT-PCR方法,观察c PLA2α不同表达水平的干细胞球中调控干性的关键转录因子NANOG,OCT4和SOX2的表达差异和上皮细胞标志物E-cadherin,间充质细胞标志物N-cadherin,vimentin,以及调控EMT的转录因子snail、twist、ZEB1的表达差异。9)采用细胞成球实验、软琼脂克隆形成实验、分化实验、趋化运动,分析c PLA2α不同表达水平的干细胞球自我更新能力、增殖能力、侵袭能力和多向分化潜能的差异。10)在Hep G2细胞中构建慢病毒c PLA2α-Tet-on可调控系统,通过可逆性调控c PLA2α表达水平观察肝癌细胞干细胞在形态上的差异以及EMT标志分子表达差异,明确c PLA2α在调控肝癌干细胞EMT可塑性转化中的作用。11)在c PLA2α降表达的细胞中构建了慢病毒PKCζ-Tet-on可调控系统,探索在降表达c PLA2α的细胞中再过表达PKCζ后,干细胞球是否会从致密性的上皮表型干细胞转变为呈松散葡萄串样的间质表型的干细胞球,阐明c PLA2α调控肝癌干细胞EMT可塑性转化的分子机制。结果1)c PLA2α在肝癌肿瘤组织中的表达高于癌旁组织,尤其在肝内微转移灶、淋巴管癌栓及靠近肿瘤侵袭边缘高表达差异明显,c PLA2α高表达与病人的不良预后密切相关。2)在体外细胞模型中,c PLA2α表达水平高的肝癌细胞,其趋化运动能力和侵袭能力高于c PLA2α表达水平低的肝癌细胞。3)在免疫缺陷小鼠体内移植瘤模型中,c PLA2α表达水平高的肝癌细胞皮下成瘤后迅速发生严重的肝内转移和远处转移,c PLA2α表达水平低的细胞皮下成瘤后没有发生明显的转移。4)c PLA2α降表达后细胞形态发生上皮样改变,同时上皮标志性蛋白E-cadhein表达上调,间质标志性蛋白N-cadherin、vimentin表达下调。c PLA2α过表达后细胞形态发生间质样改变,同时N-cadherin、vimentin表达上调,E-cadherin表达下调。5)在EGF的刺激下肝癌细胞的形态发生了间质样改变同时E-cadhein表达下调,N-cadherin、vimentin表达上调,即EGF诱导了肝癌细胞的EMT,EGF的作用被c PLA2α的降表达所抑制被c PLA2α的过表达进一步增强。6)c PLA2α的降表达抑制了EGF诱导的Akt473位点和Erk1/2的磷酸化以及EMT相关转录因子snail、twist、ZEB1的上调,c PLA2α的过表达则进一步增强EGF的诱导作用。采用PI3K抑制剂LY294002抑制PI3K通路的激活可以抑制EGF的作用,采用c PLA2α的水解产物花生四烯酸和磷脂酰肌醇可以恢复EGF对c PLA2α降表达细胞的诱导作用。7)在TGFβ的刺激下肝癌细胞的形态发生了间质样改变同时E-cadhein表达下调,N-cadherin、vimentin表达上调,即TGFβ诱导了肝癌细胞的EMT,TGFβ的作用被c PLA2α的降表达所抑制,被c PLA2α的过表达进一步增强。8)c PLA2α的降表达和LY294002均可抑制TGFβ诱导的Smad2和Erk1/2的磷酸化以及snail、twist、ZEB1的上调,花生四烯酸可以恢复TGFβ对Smad2和Erk1/2的磷酸化并诱导snail、twist、ZEB1表达上调。9)c PLA2α表达水平低的干细胞球为上皮型致密实性球,E-cadherin高表达,Ncadherin和vimentin低表达;c PLA2α表达水平高的干细胞球为间充质型葡萄串样松散球,E-cadherin低表达,N-cadherin和vimentin高表达。10)c PLA2α的表达水平低的致密型细胞球的增殖能力高于c PLA2α表达水平高的松散型细胞球,c PLA2α表达水平高的松散型细胞球的侵袭能力高于c PLA2α的表达水平低的致密型细胞球。11)c PLA2α通过PKCζ调控肝癌干细胞EMT可塑性转化。结论c PLA2α在肝癌肿瘤组织中的表达高于癌旁组织,尤其在肝内微转移灶、淋巴管癌栓及靠近肿瘤侵袭边缘高表达差异明显,c PLA2α高表达与病人的不良预后密切相关,我们推测c PLA2α可能在不同水平通过多种途径调控肿瘤细胞的侵袭和转移。c PLA2α表达水平的高低调节了肝癌细胞趋化运动能力、F-actin聚合能力的强弱。肝癌的小鼠体内移植瘤模型进一步验证了c PLA2α对肝癌细胞侵袭转移能力的影响,从两组小鼠皮下成瘤后不同的肿瘤转移情况来看,c PLA2α表达水平的高低对于肝癌细胞在体内的侵袭与迁移能力具有显著的影响。机理方面的研究发现c PLA2α调控EGF诱导的PI3K通路诱导肝癌细胞发生EMT,影响肝癌细胞的趋化运动;在TGFβ诱导肝癌细胞EMT模型中发现,TGFβ对Smads通路的激活依赖于PI3K通路的存在,c PLA2α在这一过程中发挥着关键的调控作用。在肝癌当中存在着两种肿瘤干细胞亚群—上皮表型干细胞亚群和间质表型干细胞亚群,c PLA2α通过PKCζ影响肝癌干细胞EMT的可塑性转化,影响肝癌的侵袭与转移。