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[目的](1)探明三氧化二砷(Arsenic trioxide,As2O3)饮水慢性中毒对大鼠血清甲状腺激素(Thyroidhormone,TH)以及肝组织的影响。(2)探明As2O3饮水慢性中毒对大鼠肝脏TH信号通路的影响。(3)明确As2O3对大鼠BRL-3A和RH-35细胞生长的毒性作用。(4)明确As2O3对BRL-3A和RH-35细胞TH信号通路的影响。(5)探索甲状腺激素受体β1(Thyroidhormonereceptorbeta 1,TRβ1)的表达与As2O3对BRL-3A和RH-35细胞毒性作用的相关性。[方法](1)构建As2O3饮水慢性中毒大鼠模型,观察大鼠整体一般临床表现和体重变化;放射免疫法检测血清中TH的变化;肝组织HE染色,光学显微镜下观察组织学变化。(2)通过RT-qPCR、Western Blot技术检测大鼠肝脏TH信号通路的关键调控因子TRβ1、核内途径TRβ1的下游因子(Cyclin D1)、核外途径TRβ1的下游关键因子(PI3K)基因和蛋白表达的变化,以及核外途径参与因子(Bax、Bcl-2)的蛋白表达变化。(3)培养BRL-3A和RH-35细胞,倒置显微镜观察As2O3对两种细胞的毒性作用。(4)利用MTT法检测As2O3对BRL-3A和RH-35细胞存活率的影响,筛选合适的药物浓度。(5)As2O3 分别作用 BRL-3A 和 RH-35 细胞,通过 RT-qPCR、Western Blot技术检测两种细胞TRβ1、Cyclin D1和PI3K基因和蛋白表达的变化,以及核外途径其它因子的蛋白表达变化。(6)利用激动剂GC-1对TRβ1进行干扰,通过RT-qPCR、Western Blot技术检测BRL-3A和RH-35细胞Cyclin D1和PI3K基因和蛋白表达的变化。[结果](1)As2O3饮水慢性中毒的大鼠整体一般临床表现正常,体重与对照组相比差异不显著。与对照组相比,As2O3作用110d,0.4μg/mL组雌鼠血清T4水平显著降低(P<0.05)、T4/T3 极显著降低(P<0.01)。As2O3 作用 194d,0.2μg/mL组雌鼠T3水平显著升高(P<0.05)、T4/T3显著降低(P<0.05),0.2和0.4μg/mL组雄鼠T4水平极显著升高(P<0.01),雄鼠各组血清T4/T3均升高,其中0.1μg/mL组显著升高(P<0.05),0.2和0.4μg/mL组极显著升高(P<0.01)。不同浓度的As2O3饮水引起大鼠不同程度的肝组织损伤。(2)与对照组相比,As2O3作用110d,雌鼠各组肝脏TRβ1蛋白表达均极显著降低(P<0.01),0.1和0.2μg/mL组Cyclin D1表达极显著升高(P<0.01),0.4μg/mL组PI3K表达极显著降低(P<0.01);雄鼠0.4μg/mL组TRβ1蛋白表达极显著降低(P<0.01),0.2μg/mL组TRβ1蛋白表达显著降低(P<0.05)、Cyclin D1和PI3K的表达均极显著升高(P<0.01)。As2O3作用194d,各组TRβ1蛋白表达极显著降低(P<0.01),Cyclin D1的表达均极显著升高(P<0.01),0.2μg/mL组雌鼠和雄鼠各组PI3K表达均极显著降低(P<0.01),0.4μg/mL组雌鼠PI3K表达却极显著升高(P<0.01)。mRNA表达结果与蛋白一致。此外,As2O3干扰了大鼠Bcl-2和Bax蛋白表达,并随着作用时间的增长,诱导Bcl-2/Bax蛋白比值升高。其中,各组雌鼠和0.4μg/mL组雄鼠Bcl-2/Bax比值极显著升高(P<0.01)。(3)倒置显微镜观察发现,5μM/L As2O3引起BRL-3A细胞形状变圆、颜色变黑,50μM/L As2O3引起大多数BRL-3A细胞死亡;5μM/LAs2O3引起少数RH-35细胞死亡,50μM/LAs2O3引起几乎全部RH-35细胞死亡。细胞存活率检测发现,与对照组相比,≤25μM/L的As2O3作用BRL-3A不同时间,可以促进细胞存活率;≥50μM/L的As2O3引起BRL-3A细胞存活率显著下降(P<0.01)。≤1.563μM/L的As2O3作用RH-35细胞不同时间,可以促进细胞存活率;≥6.25μM/L的As2O3引起RH-35细胞存活率显著下降(P<0.01)。6.25μM/L的As2O3作用细胞24h,BRL-3A细胞存活率为100%,RH-35细胞的存活率约51%。(4)与对照组相比,As2O3作用BRL-3A细胞12h,各组TRβ1表达极显著降低(P<0.01),1.563μM/L 组 Cyclin D1 蛋白表达升高(P<0.05),6.25μM/L 组Cyclin D1 蛋白表达降低(P<0.01)。As2O3作用 24h,1.563μM/L 组 TRβ1 显著升高(P<0.05),6.25μM/L 组 TRβ1 极显著升高(P<0.01),6.25μM/L 组 Cyclin D1的表达极显著降低(P<0.01)。As2O3作用48h,1.563μM/L组TRβ1显著降低(P<0.05),6.25μM/L组极显著升高(P<0.01),各组Cyclin D1的蛋白表达均极显著降低(P<0.01)。基因表达结果与蛋白表达结果一致。与对照组相比,As2O3作用RH-35细胞12、24h,各组TRβ1蛋白表达升高,其中,3.125和6.25μM/L组TRβ1表达极显著升高(P<0.01);As2O3作用48h,3.125和6.25μM/L组TRβ1表达极显著升高(P<0.01)。基因结果与蛋白结果一致。与对照组相比,As2O3作用RH-35 12、24、48h,各组Cyclin D1蛋白表达量均极显著降低(P<0.01)。(5)与对照组相比,As2O3作用BRL-3A细胞12h,1.563和3.125μM/L组PI3K的表达极显著升高(P<0.01),6.25μM/L组极显著降低(P<0.01)。As2O3作用24h,各组PI3K的表达均极显著低于对照组(P<0.01)。基因表达与蛋白表达结果一致。与对照组相比,As2O3作用BRL-3A细胞12h,P-PI3K表达极显著升高(P<0.01);TRα表达均极显著降低(P<0.01);6.25μM/L组Fasl的表达显著降低(P<0.05);1.563μM/L组Bax表达极显著升高(P<0.01);Bcl-2的表达极显著降低(P<0.01)。As2O3 作用 BRL-3A 细胞 24h,3.125μM/L 组 P-PI3K 的表达极显著升高(P<0.01),而6.25μM/L组则极显著降低(P<0.01);1.563μM/L组TRα表达极显著升高(P<0.01),而6.25μM/L组TRα表达极显著降低(P<0.01);Fasl的表达均极显著降低(P<0.01);3.125和6.25μM/L组Bax的表达均极显著升高(P<0.01);1.563μM/L组Bcl-2的表达极显著降低(P<0.01)。As2O3作用12、24h,引起BRL-3A细胞Bcl-2/Bax比值极显著降低(P<0.01)。(6)与对照组相比,As2O3作用RH-35细胞12、24h,各组PI3K的表达极显著降低(P<0.01),基因表达与蛋白表达结果一致。与对照组相比,As2O3作用RH-35细胞12h,P-PI3K的表达均极显著升高(P<0.01);1.563 和 6.25 μM/L 组 TRα 的表达极显著降低(P<0.01),3.125μM/L组极显著升高(P<0.01);1.563μM/L组Fasl的表达极显著降低(P<0.01);6.25μM/L组Bax的表达升高(P<0.05),3.125μM/L组Bax的表达极显著升高(P<0.01);各组Bcl-2的表达极显著降低(P<0.01)。As2O3作用24h,各组P-PI3K的表达均极显著降低(P<0.01);1.563μM/L组TR α的表达极显著升高(P<0.01);各组Fasl的表达极显著降低(P<0.01),Bax的表达极显著升高(P<0.01);1.563μM/L组Bcl-2的表达显著升高(P<0.05),其余浓度组极显著降低(P<0.01)。As2O3作用12、24h,引起RH-35细胞Bcl-2/Bax 比值极显著降低(P<0.01)。(7)与对照组相比,1.563μM/LAs2O3 作用 12h,BRL-3A 细胞 Cyclin D1、PI3K表达显著基因和蛋白升高(P<0.01),RH-35细胞Cyclin D1、PI3K基因和蛋白表达极显著降低(P<0.01)。GC-1作用12h,BRL-3A和RH-35细胞Cyclin D1、PI3K基因和蛋白表达均降低(P<0.01)。GC-1和As2O3共同作用,BRL-3A细胞Cyclin D1、PI3K表达不再升高,RH-35细胞Cyclin D1、PI3K的表达极显著降低(P<0.01)。[结论](1)As2O3饮水慢性中毒虽未对大鼠整体一般临床表现以及体重造成明显影响,却引起大鼠血清TH水平、T4/T3的比值出现异常,并导致肝组织损伤。(2)As2O3引起大鼠肝脏TRβ1的水平异常,干扰Cyclin D1、PI3K、Bax和Bcl-2的水平,影响TH核内途径的基因组效应和核外途径的非基因组效应,诱导肝损伤。(3)As2O3对BRL-3A和RH-35细胞有双向作用,即低浓度As2O3能一定程度促进两种细胞的存活率;高浓度As2O3则抑制两种细胞的存活率,诱导细胞凋亡,相对于BRL-3A细胞,As2O3对RH-35细胞的促凋亡以及抑制细胞存活率的作用更强。(4)As2O3通过干扰TRβ1的水平,影响TRβ1介导的TH信号通路核内途径和核外途径,发挥其对BRL-3A和RH-35细胞的毒性作用。从临床的观点出发,TRβ1是砷引起肝损伤疾病早期干预的潜在靶点,进一步研究靶向TH/TRβ1信号通路以防治砷引发的肝毒性具有潜在的应用价值。