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大量研究表明,成年哺乳动物脑内的某些区域终生存在神经元新生,其中最主要的两个区域是室管膜下区(subventricular zone,SVZ)和海马齿状回的颗粒下层(subgranularzone,SGZ)。而且,脑内的一些特殊区域,如纹状体、皮层、海马CA1等,在某些病理损伤的情况下也可以发生神经元新生。脑内的内源性神经干/前体细胞激活并产生新生神经元替代损伤神经元是脑内的一种自身修复机制。此外,机体还会激活各种保护性因子对损伤脑区进行修复。各种生长因子、DNA修复因子和抗凋亡蛋白等在再灌早期的表达增加可以减少细胞凋亡并促进其修复。其中,Bcl-2作为一种抗凋亡蛋白,在中枢神经系统的发育和神经退行性疾病中发挥重要作用。除了经典的抗凋亡作用,Bcl-2还可以促进培养神经细胞的轴突生长,在动物模型中增强缺血诱导的神经元新生和新生神经元的分化成熟。然而,Bcl-2是否能够促进这些体内新生神经元的突起发育,目前还并不了解。为了研究Bcl-2是否具有促进成年哺乳动物脑缺血后纹状体内新生神经元投射的作用,我们采用短暂性大脑中动脉线栓(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型联合Bcl-2质粒的侧脑室注射,用BrdU标记增殖细胞,并将逆向示踪剂-荧光金(fluorogold,FG)在缺血后第11周通过立体定位技术注射到缺血同侧的黑质网状部(substantia nigra pars reticulata,SNr)标记纹状体的投射神经元,随后采用免疫组织化学和激光共聚焦扫描技术检测纹状体新生投射神经元的情况。研究结果如下:1.成年大鼠脑缺血再灌12周质粒报告基因EGFP表达的检测为了研究过表达Bcl-2对成年大鼠缺血损伤纹状体新生神经元投射的影响,我们采用免疫组织化学的方法检测了质粒报告基因EGFP在脑内的表达情况,结果显示无论是给予Bcl-2质粒还是对照质粒,大鼠缺血侧和对侧室管膜层都没有发现EGFP免疫反应阳性细胞,两侧的皮层和纹状体也同样没有观察到EGFP免疫反应阳性细胞。结果提示,大鼠侧脑室注射的Bcl-2质粒和EGFP对照质粒表达时程较短,不足以持续到12w。2.Bcl-2高表达对缺血再灌12周时缺血性梗塞灶的影响通过CV染色和图像分析处理系统,我们发现,与缺血再灌1-4周相比,再灌第12周时纹状体缺血侧梗塞区域已不明显,主要集中在纹状体外侧区域,且细胞排列密集而紊乱,核深染且小而致密。此外,再灌12周时pBcl-2组与pEGFP组的梗塞体积也没有明显差异。皮层的梗塞区域也具有类似特征。结果提示,缺血后过表达Bcl-2对缺血性梗塞灶的修复作用具有时效性。为进一步分析缺血再灌第12周梗塞体积减少的可能原因,我们采用免疫组织化学染色标记GFAP观察星形胶质细胞的变化情况。结果显示,纹状体梗塞区域与非梗塞区域的GFAP分布界限明显,与CV染色所显示界限基本一致;同时,Bcl-2高表达并未显著改变GFAP阳性细胞的分布情况。此外,梗塞区内GFAP阳性细胞呈现出明显的活化星形胶质细胞的形态特征。结果提示,活化的星形胶质细胞也可能参与了缺血再灌长时程条件下的梗塞灶修复过程。3.Bcl-2高表达促进成年大鼠脑缺血诱导的纹状体新生神经元向同侧黑质网状部的投射如前所述,为了研究缺血后高表达Bcl-2对纹状体新生投射神经元的影响,我们在缺血后第11周时通过立体定位技术向同侧黑质网状部注射逆向示踪剂FG来标记纹状体的投射神经元。通过紫外显微镜观察荧光注射点以及FG在皮层和纹状体的表达情况,来确定和保证注射点的准确。在此基础上,我们通过免疫荧光标记的方法观察纹状体的新生神经元情况。结果显示,新生细胞(BrdU+)主要集中分布在梗塞区内,其中绝大多数为新生成熟神经元(BrdU+-NeuN+或BrdU+-MAP-2+);并且梗塞周边区的一部分新生神经元已经具有了成熟投射神经元的特征(BrdU+-FG+-NeuN+或BrdU+-FG+-MAP-2+);此外,纹状体的投射细胞(FG+)都具有成熟神经元(NeuN+或MAP-2+)的特征。结果提示,纹状体一部分新生神经元经过一定时间逐渐发育成熟,并且可以投射到同侧的黑质网状部。通过计数新生投射神经元,我们还发现,缺血后高表达Bcl-2,纹状体新生细胞(BrdU+)数量和新生投射神经元(BrdU+-FG+)的数量都有显著增加,分别由pEGFP 组的 117.7± 16.2 和 21.8±4.3 增加到 pBcl-2 组的 506.0± 197.3(P<0.05)和114.6±28.0(P<0.05)。结果提示,脑缺血后高表达Bcl-2可以显著促进纹状体新生神经元向黑质网状部投射。小结:1.成年大鼠脑缺血后高表达Bcl-2有一定的时效性,并且对缺血梗塞灶的修复作用也有一定的时效性。2.成年大鼠脑缺血后高表达Bcl-2促进缺血诱导的纹状体神经再生及新生成熟神经元向同侧黑质网状部的投射。结论:成年大鼠脑缺血后高表达Bcl-2促进缺血诱导的纹状体新生神经元向同侧黑质网状部的投射。