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研究证明人类白细胞抗原-G(human leukocyte antigen-G, HLA-G)最初发现于母胎界面,免疫学家们证实其是保护胎儿免受母体免疫系统的监视与排斥的作用机制之一。HLA-G是一种免疫耐受分子,通过多种途径参与免疫应答而发挥免疫抑制功能,因此逐渐成为器官移植领域关注的热点。研究证实HLA-G与器官移植排斥反应和移植物功能良好具有相关性。HLA-G包括膜型和可溶型,其中可溶型HLA-G5(soluble human leukocyte antigen-G,sHLA-G)是结构和功能较为明确的亚型。sHLA-G5是否能够作为判断肾移植预后的生物标志分子,以及sHLA-G5的浓度与其效应关系,肾移植早期抗IL-2受体单克隆抗体是否影响sHLA-G5的表达,目前国内外尚未见报道。本课题就此展开研究。首先,本研究把215例肾移植受者分为肾功稳定组(F组,n=173)、急性排斥组(AR组,n=42),健康供者为对照组(H组,n=69)。结果显示,术前、术后肾移植受者外周血中,mHLA-G1在CD4+、CD8+、CD19+和CD16+56+各淋巴细胞亚群的表达比率均较低,且各组间差异无统计学差异。术前sHLA-G5表达在F、AR、H三组分别平均为33.43±21.46ng/ml、31.90±20.12ng/ml和24.94±13.19ng/ml,进行组间比较,F组sHLA-G5水平高于H组,差异具有统计学意义(p<0.05)。而F组和AR组两组间差异无统计学意义(p>0.05),H组和AR组两组间差异无统计学意义(p>0.05)。在肾移植术后为期12周的动态观察,F组sHLA-G5的表达水平高于AR组,并且移植肾组织组化显示,21例肾移植受者发生急性排斥反应中17例HLA-G5表达阴性。经ROC曲线得出,sHLA-G5水平预测急性排斥反应的最适cutoff值为139.0ng/ml,其敏感性和特异性均较高。同时采用Western blot验证sHLA-G5在H组、F组、AR组呈现不同水平的表达,F组表达逐渐增加,明显高于AR组。RT-PCR进一步分析F组和AR组肾移植受者体内的sHLA-G5 mRNA水平,AR组的肾移植受者外周血sHLA-G5表达水平较低,其mRNA表达较低;F组术后HLA-G5 mRNA表达逐渐上调。215例肾移植受者按照CMV活动性感染与否分为CMV(+)和CMV(-)组,CMV(+)组和CMV(-)组外周血淋巴细胞上mHLA-G1呈低表达,CMV-pp65阳性时淋巴细胞mHLA-G1的表达无明显变化。CMV(+)组在CMV-pp65阳性期,即CMV活动性感染阶段,外周血CD14+mHLA-G1+显著升高,达到45.53±17.32%,转阴后下降至10.22±5.78%。CMV(+)组的sHLA-G5表达水平明显升高。sHLA-G5含量预测CMV活动性感染的最适cutoff值为202.9ng/ml,具有很高的诊断准确性。在CMV活动性感染的12例移植肾组织中10例HLA-G表达阳性。Western blot验证sHLA-G5的表达情况,CMV(+)组的sHLA-G5表达明显高于CMV(-)组,RT-PCR分析CMV(+)组和CMV(-)组的肾移植受者sHLA-G5的mRNA水平;显示CMV(+)组高于CMV(-)组。其次,选择原核表达系统,利用PCR技术获得HLA-G基因,构建HLA-G5的原核表达载体PET28a-HLA-G,获得重组表达质粒,实现在E.coli BL21(DE3)宿主菌中sHLA-G5的高效表达。获取足够蛋白,观察不同浓度的原核表达sHLA-G5蛋白对混合淋巴培养体系中T细胞增殖的影响,探索sHLA-G5的浓度与其效应关系,为临床研究提供理论依据。9对活体肾移植供、受者间进行混合淋巴培养,CFSE标记混合淋巴培养体系中受者CD3+T细胞,7天后收集细胞分析增殖情况,结果表明构建的sHLA-G5蛋白能够抑制同种异体T细胞的增殖,在混合淋巴培养体系中,当加入低于0.25μg /ml时,抑制作用随着浓度的增加而增强,当达到1.0μg/ml,尽管抑制作用与对照组比较具有差异,但并非与浓度呈正相关。进一步流式细胞术分析发现,CD4lowT细胞、CD8lowT细胞的比率随着sHLA-G5浓度的增加,CD4+T、CD8+T细胞增殖受到抑制,但细胞发生了变化,CD4lowT细胞、CD8lowT细胞所占比率明显增加。最后,探讨抗IL-2R单克隆抗体应用对sHLA-G5表达的影响,并且分析sHLA-G5的产生及水平上调是否为抗IL-2受体单克隆抗体一个新的作用机理。结果显示首剂抗IL-2R单克隆抗体使用后,即可诱导促进sHLA-G5的表达。肾移植术后1d、4d、1w、2w,抗体使用组受者的sHLA-G5的表达水平明显高于未使用抗体组。另外,术前首剂抗IL-2R单克隆抗体的应用影响肾移植受者外周血中的细胞因子的转换,IFN-γ、TNF-α明显减低,IL-10升高,提供了利于sHLA-G5表达上调的微环境。2剂应用后IL-10、IL-4升高,造成肾移植受者外周循环中Th2占优势。以上结果证明:在肾移植受者外周血中,HLA-G在肾移植受者外周血中的主要表达亚型为sHLA-G5。术后肾功稳定组的sHLA-G5水平高于健康对照组和急性排斥组。ROC曲线分析得出sHLA-G5水平139.0 ng/ml作为cutoff阈值,具有很好的判断急性排斥反应发生的意义。ROC曲线分析得出sHLA-G5水平202.9 ng/ml作为cutoff阈值,具有很好的判断CMV活动性感染的价值。CMV(+)组肾移植受者在减低甚至停用免疫抑制剂后,移植肾功能仍良好。其可能机制为:CMV(+)组sHLA-G5在外周血的表达水平显著升高,移植物肾小管上皮细胞的HLA-G阳性表达提示sHLA-G5的表达保护移植肾功能。原核表达系统表达HLA-G5蛋白,镍亲和层析柱获得了纯度较高的HLA-G5蛋白,并有效复性获得了纯度达90%的sHLA-G5蛋白。原核表达的sHLA-G5在混合淋巴培养体系中的效应显示与浓度相关性,在一定范围内,呈浓度依赖性,但并非呈正相关。当浓度高于1.0 ng/ml时,其抑制T细胞增殖能力没有增强,而是出现下降趋势。sHLA-G5在混合淋巴培养体系中的效应显示与浓度相关性,在一定范围内,呈浓度依赖性,但并非呈正相关。当浓度高于1.0 ng/ml时,其抑制T细胞增殖能力没有增强,而是出现下降趋势。在肾移植术后早期应用抗IL-2R单克隆抗体能够诱导sHLA-G5的表达上调;抗IL-2R单克隆抗体影响肾移植受者外周血中的细胞因子的漂移,这种漂移的免疫方向利于移植物的保护,从而降低排斥反应发生的可能性。在肾移植术后早期应用抗IL-2R单克隆抗体能够诱导sHLA-G5的表达上调。术前首剂抗IL-2R单克隆抗体的应用影响肾移植受者外周血中的细胞因子的转换,IFN-γ、TNF-α明显减低,IL-10升高,提供了利于sHLA-G5表达上调的微环境。2剂应用后IL-10、IL-4升高,造成肾移植受者外周循环中Th2占优势漂移,这种调节选择对移植物保护性的免疫方向,从而降低排斥反应发生的可能性。