论文部分内容阅读
新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒,可引起禽类新城疫。20世纪50年代人们偶然间发现了NDV具有抗肿瘤作用。经过数十年的研究,目前已经证实NDV弱毒株可以选择性杀伤人颈部癌细胞系(KB825211)、成神经纤维瘤细胞系(IMR32)、Wilim肿瘤细胞系(G104)、纤维肉瘤细胞系(HT1080)、膀胱癌细胞系(HCV29)、骨肉瘤细胞系(KHOS)等多种人和动物的肿瘤细胞,对正常成纤维细胞无害。同时人们也已初步了解其抗肿瘤机制,有诱导细胞因子的产生、对免疫细胞有调节作用、对癌细胞的选择性杀伤作用及其HN蛋白的抗肿瘤作用等几个方面。但是对其确切的抗肿瘤机制仍然尚未完全了解。对NDV抗肿瘤机制进行深入研究,进一步阐明其抗肿瘤的机制及途径,成为亟待解决的问题。制备纯化新城疫病毒,食管癌细胞ECA109常规传代培养。NDV体外感染ECA109细胞,采用CCK-8法检测不同浓度、不同时相NDV对食管癌细胞ECA109的抑制作用,计算抑制率和增殖率;然后收集NDV感染后的ECA109细胞,离心、洗涤后,加入Annexin V-FITC及PI孵育后,流式细胞仪检测细胞凋亡情况;提取NDV感染后的ECA109细胞基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳,检测DNA有无断裂。收集NDV感染后的ECA109细胞,戊二醛固定后,制备超薄切片,透射电镜观察病毒颗粒及细胞内线粒体的变化。免疫细胞化学、western blot等方法检测细胞色素C,Bcl-2,caspase-8,Bax等的表达情况。结果显示NDV能够显著抑制ECA109细胞增殖,并且其抑制增殖作用具有时间和剂量依赖性。流式细胞术结合FITC-PI双染色法结果显示不同浓度NDV作用于ECA109细胞后凋亡率分别为8.96±0.31%、10.93±1.11%、18.30±1.21%和22.13±1.53%,与阴性对照组2.4±0.36%相比,具有统计学差异(p<0.05),说明NDV可诱导ECA109细胞凋亡。DNA凝胶电泳结果显示NDV处理可使ECA109细胞的DNA断裂成梯状条带,阴性对照组则无此现象。电子显微镜下观察线粒体,发现其明显肿胀、嵴断裂、减少或消失。Western blot、免疫细胞化学(ICC)结果显示促凋亡蛋白如caspase-9,caspase-8,Bax和细胞色素C表达随NDV的浓度增高而增强,Bcl-2表达随NDV浓度的增加而减弱。本课题采用CCK-8法、DNA-ladder、免疫细胞化学技术、WB法、电子显微镜技术等研究NDV对食管癌细胞ECA109的杀伤作用及其信号传导途径来进一步阐明NDV的抗肿瘤机制,为食管癌的生物治疗提供了理论基础。