吸烟已构成世界范围内的健康危害,流行病学证据显示,香烟烟雾暴露与人群肺癌发生率之间存在相关性,已有大量研究证实吸烟与肺癌及其他器官病变之间的因果关系。肺癌是当今世界对人群健康构成重大威胁的最常见恶性肿瘤之一,尽管吸烟与肺癌关系的研究已较广泛开展,但多数研究是流行病学调查,而对于吸烟所致肺癌的分子机制深入研究报道甚少。所以,虽已证实吸烟是肺癌的首要危险因素,但吸烟所致肺癌的分子机制还有待进一步研究。长期暴露于香烟烟雾会导致肺组织损伤,诱发炎症反应并促进肺癌发生。炎性因子介导的信号通路参与了肿瘤细胞的恶性演进,而上皮-间质转化(EMT)是肿瘤恶性演进过程中的关键机制,因此EMT又被认为是炎症和肿瘤之间的桥梁。在EMT和癌症转移过程中,很多炎症相关的miRNAs成为EMT与炎症之间关联的纽带,如miR-200家族可通过靶向调控E型钙黏蛋白(E-cadherin)的转录抑制因子E盒结合锌指蛋白(ZEB1和ZEB2)的表达,维持细胞上皮表型从而调控EMT过程。香烟抽提物(CSE)通过激活核转录因子-κB(NF-κB)调控炎性反应影响miR-200c水平进而在CSE所致EMT和细胞恶性转化及致瘤性中发挥重要作用尚未见研究报道。为此,本研究构建了 CSE慢性处理所致人支气管上皮(HBE)细胞恶性转化模型,并且在此基础上,应用多种分子生物学方法探讨NF-κB激活对白细胞介素-6(IL-6)和miR-200c水平的影响,从而拟揭示NF-κB调控炎症反应和EMT在CSE所致HBE细胞恶性转化及致瘤性中的作用,为吸烟所致肺癌的分子机制研究提供科学线索,从而为进一步寻找香烟所致肺癌的生物标志及防控措施提供一定的科学依据。方法一、香烟抽提物对HBE细胞毒性和恶性转化及致瘤性的影响分别用 0,5,10,20,50 或 100 μg/mLCSE 处理 HBE 细胞 24 或 48h 后,用CCK-8实验检测细胞毒性;分别用0或20 μg/mL作为诱导HBE细胞恶性转化的剂量,每2d传代一次,慢性处理HBE细胞至40代(约20 w)后,用软琼脂集落实验观察细胞恶性程度,用裸鼠皮下成瘤实验检测细胞致瘤性。以观察CSE对HBE细胞毒性和恶性转化及致瘤性的影响。二、香烟抽提物对HBE细胞发生EMT的影响分别用0或20μg/mL CSE慢性处理HBE细胞0、20、30和40代后,在倒置显微镜下观察细胞形态,用Westerrn blot和免疫荧光实验检测EMT标志蛋白表达水平;分别用0或20 μg/mL CSE慢性处理HBE细胞40代(约20 w)后;或分别用0或20 μg/mL CSE处理HBE细胞0、6、12和24 h后,用qRT-PCR检测细胞miR-200c水平。以观察CSE对HBE细胞发生EMT的影响。三、香烟抽提物对HBE细胞IL-6水平的影响分别用0或20 μg/mL CSE慢性处理HBE细胞40代(约20 w)后;或分别用0或20μg/mLCSE处理HBE细胞0、6、12和24h后,分别用RT-PCR和ELISA实验检测细胞IL-6表达和分泌水平。以观察CSE对HBE细胞IL-6水平的影响。四、IL-6在香烟抽提物所致HBE细胞miR-200c水平降低和细胞恶性转化中的作用用0.5 μg/mL anti-IL-6中和抗体或anti-IgG抗体联合0或20 μg/mL CSE处理HBE细胞24 h后,用ELISA实验检测细胞IL-6分泌水平,用qRT-PCR检测细胞miR-200c水平;或分别用0或20 μg/mL CSE慢性处理HBE细胞40代(约20 w)后,再用0.5 μg/mL anti-IL-6中和抗体或anti-IgG抗体处理CSE慢性处理诱导的恶性转化HBE细胞3 d,用软琼脂集落实验检测细胞恶性程度。以观察IL-6在CSE所致HBE细胞miR-200c水平降低和细胞恶性转化中的作用。五、香烟抽提物对HBE细胞NF-KB激活的影响分别用0或20 μg/mL CSE慢性处理HBE细胞40代(约20 w)后;或分别用 0 或 20 μg/mL CSE 处理 HBE 细胞 0、6、12 和 24 h 后,用 Western blot 检测NF-κB p65水平及其磷酸化程度。以观察CSE对HBE细胞NF-κB激活的影响。六、NF-κB在香烟抽提物所致HBE细胞IL-6水平升高及miR-200c水平降低中的作用用10 μMNF-κB抑制剂Bay11-7082预处理3 h,再联合用0或20 μg/mL CSE处理24 h后,用Western blot检测NF-κB p65水平及其磷酸化程度,用免疫荧光实验检测p-NF-κB p65蛋白在细胞内分布情况,分别用RT-PCR和ELISA实验检测细胞IL-6表达和分泌水平,用qRT-PCR检测miR-200c水平;或用10 μM NF-κB抑制剂Bay1 1-7082预处理3 h,再加入10 ng/mL的人重组细胞因子IL-6,并联合0或20 μg/mL CSE处理24 h后,用qRT-PCR检测细胞miR-200c水平。以观察NF-κB在CSE所致HBE细胞IL-6水平升高及miR-200c水平降低中的作用。七、NF-κB在香烟抽提物慢性处理所致HBE细胞IL-6水平升高中的作用用10 μM NF-κB抑制剂Bay1 1-7082预处理3 h,再联合0或20 μg/mL CSE处理24 h,每2 d传代一次,照此方式慢性处理HBE细胞至40代(约20 w)后,用Western blot检测NF-κB p65水平及其磷酸化程度,分别用RT-PCR和ELISA实验检测IL-6表达和分泌水平。以观察NF-κB在CSE慢性处理所致HBE细胞IL-6水平升高中的作用。八、NF-κB在香烟抽提物慢性处理所致HBE细胞EMT标志改变及恶性转化中的作用用10 μM NF-κB抑制剂Bay1 1-7082预处理3 h,再联合0或20 μg/mL CSE处理24 h,每2 d传代一次,照此方式慢性处理HBE细胞至40代(约20 w)后,用Western blot检测EMT标志蛋白水平,用qRT-PCR检测细胞miR-200c水平,用软琼脂集落实验检测细胞恶性程度。以观察NF-κB在CSE慢性处理所致HBE细胞EMT标志改变及恶性转化中的作用。结果一、香烟抽提物对HBE细胞毒性和恶性转化及致瘤性的影响结果发现50和100μg/mL CSE对HBE细胞具有明显毒性作用,而20 μg/mL及以下浓度CSE对HBE细胞无明显毒性作用;20 μg/mL CSE慢性处理HBE细胞40代(约20 w)所致恶性转化HBE细胞可在软琼脂上形成集落,在裸鼠皮下形成肿瘤,肿瘤组织病理学切片显示为低分化上皮样癌细胞。说明CSE能够引起HBE细胞发生恶性转化并具有致瘤性。二、香烟抽提物对HBE细胞发生EMT的影响结果发现20μg/mLCSE慢性处理HBE细胞,随处理代数增加,细胞逐渐呈现上皮样-梭形间质样形态;上皮细胞标志E-cadherin水平及荧光强度逐渐降低,而间质细胞标志N-cadherin和vimentin水平及荧光强度逐渐升高;20 μg/mL CSE慢性和急性处理均可引起HBE细胞miR-200c水平降低。说明CSE慢性处理可诱导HBE细胞发生EMT。三、香烟抽提物对HBE细胞IL-6水平的影响结果发现20 μg/mL CSE慢性处理40代所致恶性转化HBE细胞IL-6mRNA水平和分泌水平均明显升高;20 μg/mL CSE处理12和24 h的HBE细胞IL-6 mRNA水平和分泌水平均显著升高,并具有一定的时间效应关系。说明CSE可上调IL-6水平进而诱导HBE细胞发生炎症反应。四、IL-6在香烟抽提物所致HBE细胞miR-200c水平降低和细胞恶性转化中的作用结果发现anti-IL-6中和抗体可以明显阻滞20 μg/mL CSE所致HBE细胞IL-6分泌水平升高和miR-200c水平降低;而且anti-IL-6中和抗体处理的恶性转化HBE细胞在软琼脂上形成细胞集落数显著低于20 μg/mL CSE慢性处理所致恶性转化HBE细胞。说明IL-6在CSE所致HBE细胞miR-200c水平降低和细胞恶性转化中发挥重要作用。五、香烟抽提物对HBE细胞NF-κB激活的影响结果发现20 μg/mL CSE慢性处理40代的恶性转化HBE细胞p-NF-κB p65水平明显升高;而20μg/mL CSE处理12和24 h的HBE细胞p-NF-κB p65水平均显著升高,并具有一定时间效应关系。说明CSE能够激活NF-κB并且NF-κB可能在CSE诱导的细胞恶性转化中发挥重要作用。六、NF-κB在香烟抽提物所致HBE细胞IL-6水平升高及miR-200c水平降低中的作用结果发现NF-κB抑制剂Bay11-7082可阻滞20 μg/mL CSE处理所致HBE细胞p-NF-κB p65水平升高和蛋白核转位、IL-6水平升高、miR-200c水平降低;抑制NF-κB激活后进一步上调IL-6水平可逆转其对miR-200c水平的上调作用。说明NF-κB激活在CSE处理HBE细胞所致IL-6水平升高及miR-200c水平降低中发挥重要作用。七、NF-κB在香烟抽提物慢性处理所致HBE细胞IL-6水平升高中的作用结果发现20 μg/mL CSE慢性处理40代的恶性转化HBE细胞p-NF-KB p65水平、IL-6 mRNA水平和分泌均明显升高;而NF-κB抑制剂Bay1 1-7082长期处理可阻滞CSE慢性处理所致HBE细胞p-NF-κB p65水平、IL-6 mRNA水平和分泌量升高;说明NF-κB激活在CSE慢性处理所致HBE细胞IL-6水平升高中具有重要作用。八、NF-κB在香烟抽提物慢性处理所致HBE细胞EMT标志改变及恶性转化中的作用结果发现NF-κB抑制剂Bay11-7082长期处理可阻滞20 μg/mL CSE慢性处理引起的HBE 细胞 E-cadherin水平和 miR-200c水平降低及 N-cadherin 和 vimentin水平上升;Bay11-7082联合20 μg/mL CSE处理HBE细胞在软琼脂上形成细胞集落数显著低于单独CSE慢性处理HBE细胞。说明NF-κB激活在CSE处理所致HBE细胞EMT标志改变及恶性转化中发挥重要作用。结论1、CSE慢性处理可诱导HBE细胞发生EMT、恶性转化及致瘤性。2、CSE慢性处理可诱导HBE细胞发生炎症反应,且炎性因子IL-6在CSE慢性处理所致EMT及细胞恶性转化中发挥重要作用。3、NF-κB调控IL-6诱导EMT在CSE所致细胞恶性转化中发挥重要作用。