棉花枯萎病生防放线菌的筛选、鉴定及其防治作用研究

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:tingyuan2009
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棉花枯萎病(Fusarium wilt of cotton)是由尖镰孢萎蔫专化型[Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum(Atk.)W.C.Snyder&H.N.Hans]引起的维管束病害,是限制棉花生产最主要的病害之一。目前用于防治这种病害的措施包括栽培抗病品种、轮作和施用化学药剂等。化学药剂往往在施用初期有效,但其过度施用会导致环境污染、危害人类健康,且病原菌很容易对其产生抗药性。因此,亟待寻求环境友好的防治方法来减少化学药剂的使用。本研究通过平板对峙、温室盆栽和次生代谢产物检测等方法综合筛选了拮抗棉花枯萎病菌的生防放线菌,并以生防链霉菌XN-04为研究对象,对其进行了发酵培养基的优化和抗真菌活性成分的初步研究,论文主要研究结果如下:(1)棉花枯萎病生防放线菌的分离、筛选与鉴定。从甘肃、西宁两地采集的作物根际土样品中分离、纯化到放线菌32株,其编号为GS-01至GS-10,以及XN-01至XN-22。采用平板对峙法进行初步筛选,得到对棉花枯萎病菌有较强抑制作用的生防放线菌GS-01、GS-03、XN-01和XN-04,随后的抑菌谱试验表明这4株生防菌具有广谱的抗菌物活性。通过形态学观察、培养特征系观察、生理生化特征观察、菌株生态条件耐受性和16S r DNA序列分析,初步确定GS-01、GS-03、XN-01和XN-04分别与Amycolatopsis speibonae,Streptomyces spectabilis,S.atroolivaceus和S.alfalfae亲缘关系较近。(2)生防放线菌对棉花幼苗的影响及对棉花枯萎病的防治效果。用4株生防菌的发酵液对棉种进行浸种盆栽,结果表明生防菌处理对棉花的生物量积累促进作用明显。将棉花枯萎病菌和生防菌发酵液先后在棉花上接种进行温室盆栽防病试验,结果表明4株生防菌对棉花枯萎病的防效分别为40.50%、51.72%、49.49%和56.58,其中XN-04对棉花枯萎病的防效略高于药剂对照多菌灵(52.40%)。(3)生防放线菌次生代谢产物检测。对4株生防菌进行了真菌细胞壁水解酶(几丁质酶,纤维素酶等)合成能力的检测,以及产生铁载体、产IAA等促生指标的检测,结果表明4株生防菌均具有一定的防病促生潜力。(4)生防菌XN-04的发酵优化。液体摇培条件下,XN-04的抗真菌活性成分位于菌丝体内,首先采用单因素试验优化碳、氮源,无机盐和微量元素,筛选得到7个最佳的培养基底物,并确定了它们的最佳浓度。在此基础上进行Plackett-Burman试验,得到了3个主要影响因子,之后的最陡爬坡试验和Box-Benhnken试验使这三个因子的浓度不断逼近最佳区域。最后通过响应面分析获得了XN-04发酵培养基的最佳成分和浓度,验证试验结果表明,与初始的高氏一号培养液相比,优化后的培养基使XN-04的菌丝干重增加了7.5倍,而每单位体积菌丝体的丙酮浸提液所表现的对棉花枯萎病菌的抑制率也略有增强。(5)生防菌XN-04抗真菌活性成分的初步分离。XN-04的活性物质易溶于有机溶剂,该组分在捷克八溶剂系统层析的Rf谱图与第五类抗生素相似。(6)生防菌XN-04抗真菌活性成分的稳定性分析。稳定性试验结果表明XN-04的活性成分在温度低于100℃时稳定,在p H 2-12环境下稳定,在光照96 h内稳定,在紫外照射0-240 min条件下稳定性略有下降,4℃保存8个月抑菌活性无明显变化,蛋白酶K处理对其活性无明显影响。(7)生防菌XN-04的基因组学分析。XN-04全基因组大小为8.28 Mb,包括一个大小为8.25 Mb的染色体和一个大小为24.56 Kb的环状质粒,全基因组G+C含量为72.06%。通过anti SMASH5.0预测得到了33个次生代谢产物生物合成基因簇。上述研究结果为开发和利用生防链霉菌XN-04防治棉花枯萎病提供了理论依据。同时,链霉菌XN-04的基因组分析为从基因水平上进行该菌株的遗传改造提供了理论基础。
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