甘蓝型油菜七个CIPK基因的cDNA克隆、表达分析与互作CBL蛋白鉴定

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类钙调磷酸酶B互作蛋白激酶(calcineurin B-like interacting protein kinase,CIPK)是植物中广泛存在的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,与上游CBL(calcineurin B-like protein)蛋白结合,形成CBL-CIPK复合物,在钙信号的传递过程中发挥重要作用,而钙信号作为细胞内存在第二信使,在调控植物生长、发育以及非生物与生物逆境等信号通路中发挥重要作用。虽然目前对拟南芥和水稻中的CIPK研究的比较深入,报道的比较多,但在其他物种中的相关报道较少。油菜(Brassica napus L.)基因组比较大,基因组测序完成的比较晚,因此油菜中尚有一些CIPK基因未被挖掘研究。而油菜作为我国重要的油料作物有着重要的经济价值和实用价值,油菜籽的产量及品质经常受到环境和病虫害的影响,从分子水平研究油菜中的抗逆基因资源在探索提高植物抗逆性方面意义重大。本研究以甘蓝型油菜为试验材料,首先通过RT-PCR克隆得到七个CIPK基因的c DNA序列。对七个预测基因与拟南芥的同源基因进行多重序列比对,构建进化树,分析了新克隆的七个基因与拟南芥、水稻、高粱、葡萄、小立碗藓、亮球菌、牛柳链球菌同源基因间的进化关系;q RT-PCR分析了Bna CIPK2、Bna CIPK13、Bna CIPK16、Bna CIPK18在激素脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)以及热害、冷害、双氧水、模拟干旱、盐害、甲基紫精(MV)处理下的表达特性;利用绿色荧光蛋白分析了七个Bna CIPK的亚细胞定位;酵母双杂交试验探索了七个Bna CIPK的互作蛋白以及通过双分子荧光互补试验对互作蛋白进行了验证。分析表明新克隆的Bna CIPK基因编码的蛋白含有保守的激酶结构域与NAF基序,在进化上七个CIPKs基因与拟南芥的亲缘关系更近;发现茉莉酸、冷害以及聚乙二醇(PEG)8000显著诱导Bna CIPK2的表达,甲基紫精处理24 h后可抑制Bna CIPK2、Bna CIPK13表达;水杨酸、热害、冷害、双氧水和PEG8000可诱导Bna CIPK16的表达量上调,茉莉酸和脱落酸处理则导致Bna CIPK16的表达量下调但均没有显著性;热害、盐害处理诱导Bna CIPK13的表达量显著性降低,双氧水处理1h其表达量显著性上调,之后会有所回落,Bna CIPK18在ABA处理下有所上调。在酵母双杂互作蛋白筛选中发现Bna CBL4-Bna CIPK2,Bna CBL3-Bna CIPK16,Bna CBL4-Bna CIPK18,Bna CBL1、Bna CBL9-Bna CIPK20之间存在互作,继而在双分子荧光互补实验中(Bi FC)得到了验证。此外,还发现Bna CIPK26与多个ABF、AREB转录因子互作,并且与PP2C家族中的Bna HAB1间存在互作。以上这些结果说明不同的油菜CIPK基因在表达模式上存在差异,可能参与不同的胁迫响应信号中,为深入阐明新克隆的油菜CIPKs基因的功能与调控机制奠定了基础。
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