分支酶修饰蜡质大米淀粉结构与性质研究

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淀粉改性能改善大多数天然淀粉不溶于冷水、糊化后易老化、低温发生凝沉等不足,在食品工业中有广泛的应用。其制备途径包括物理改性、化学改性和酶法改性。其中,酶法反应效率高、反应条件温和且产物环保,适于大规模工业生产应用。分支酶具有断裂α-1,4-糖苷键和形成α-1,6-糖苷键的水解转苷催化特性,是修饰改性淀粉的一种重要的酶类。本课题利用分支酶对蜡质大米淀粉进行修饰改性,并对得到的酶改性淀粉进行结构分析,在此基础上,以β-胡萝卜素为例考察该酶改性淀粉在营养素载运方面的应用,主要研究内容及结果如下:首先,本课题利用基因工程获得来源于Bacillus stearothermophilus的分支酶基因片段,将其连接到pET-22b(+)载体上,构建得到重组质粒。重组质粒在大肠杆菌E.coli BL21中经异丙基-β-D-硫代半乳糖糖苷(IPTG)诱导表达获得重组分支酶,经测定,该蛋白酶相对分子质量为70 kDa,最适温度为75℃且具有良好的热稳定性,最适pH为7.0,在pH 6.09.5均保持稳定。其次,利用分支酶对蜡质大米淀粉进行修饰改性。对改性淀粉的结构分析,表明经分支酶处理后,一方面蜡质大米淀粉相对分子质量的重均值Mw和分散性均降低,链段呈现A链(DP≤13)增多,B链(DP>13)含量减少的分布变化,推测该分支酶更倾向于将中长链段水解成短链段,作为后续反应的片段;另一方面α-1,6糖苷键的含量由5.0%提高至6.6%,产生DP 1934的环状结构,形成分支环状改性结构。对酶改性淀粉的溶解度、粘度和消化特性分析,结果表明,酶改性淀粉在冷水中的溶解度达到83.3g/100 mL(25℃),在室温下即可溶解形成均一的溶液;粘度相比于蜡质大米淀粉显著降低,只有蜡质大米淀粉的1/10000左右;经过分支酶处理后,慢消化淀粉(SDS)含量由8.5%提高至21.0%,抗消化淀粉(RS)的含量由6.9%增加至18.5%,推测与分支酶改性修饰形成的分支环状结构有关。随后,对酶改性淀粉中的分支环状特征结构分析,表明该分支环状特征结构平均由21个葡萄糖单元组成,环状结构中含有19个葡萄糖单元,其余的两个葡萄糖单元以α-1,6糖苷键连接在环上作为端基,结构中键型包括α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键,其中α-1,6糖苷键以平均间隔5.6个葡萄糖单元进行分布。结合分子动力学模拟软件Discovery Studio 3.5(DS 3.5)、紫外-可见光谱仪全波长扫描仪和等温滴定量热仪(ITC)对该分支环状结构特性分析,发现该分支环状特征结构具有与大环糊精类似的疏水性空腔,可复合碘类的疏水性物质。最后,以该酶改性淀粉制备β-胡萝卜素/酶改性淀粉的包合物。经测定,由质量比为1:5(β-胡萝卜素:酶改性淀粉)形成的包合物中,β-胡萝卜素的溶解度为179.1μg/mL,负载率和包埋量分别为1.3%和8.9μg/mg。利用傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)、X-射线衍射(XRD)、热重分析仪(TGA)和差示热量扫描仪(DSC)等现代分析技术对包合物进行特性表征显示,β-胡萝卜素包合后由晶型结构转变为无定型结构。以β-胡萝卜素为对照,进行稳定性实验,结果表明在室温下光照六周后,β-胡萝卜素/酶改性淀粉包合物中β-胡萝卜素的保留率高于对照组;在FeCl3化学氧化下1 h后,β-胡萝卜素/酶改性淀粉包合物中β-胡萝卜素保留率仍高于80%,表明该酶改性淀粉对β-胡萝卜素的光照稳定性和氧化稳定性具有提高作用。
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