研究背景:血管性痴呆(vasculardementia,VaD)是指由缺血性脑卒中、出血性脑卒中或造成记忆、认知和行为相关脑区低灌注的各种脑血管疾病所引起的认知功能障碍综合征,主要表现为语言、运动和空间知觉能力障碍及人格障碍等,其确切发病机制目前尚不清楚。欧美发达国家流行病学资料显示,VaD的患病率是0.9%-3.0%,在所有痴呆中约占15%到20%,其发病率仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)[1]。在我国,60岁以上老年人群中,血管性痴呆的患病率1.1%～3.0%,年发病率在5～9/1000,而且其发病率有逐年增高的趋势,是引起老年期痴呆和导致老年人生活质量下降的重要因素之一[2]。因此,VaD不仅给患者本人带来了极大痛苦,影响其生活质量,也给家庭和社会带来了沉重负担,如何预防和治疗VaD成为目前亟须解决的医学课题之一。运动干预策略作为脑血管病康复治疗的手段之一,在临床治疗实践中被广泛应用,其对VaD认知功能恢复的效果,甚至对脑血管病综合治疗的重要意义已得到国际医学界的认同。但我国目前尚无较完善的、适合我国国情的脑血管病三级康复体系,大量脑血管病患者经急性期治疗后,未能得到系统的康复治疗,因此运动干预策略的研究与合理应用对于我国的VaD患者有特殊的意义。谷氨酸(Glu)是中枢神经系统内含量最高及最重要的兴奋性氨基酸,广泛分布于中枢神经系统的大脑皮层、海马、小脑、纹状体和基底神经核等部位,通过与其相应的Glu受体结合后参与大脑的学习、记忆、运动、感觉等诸多重要生理功能。进一步研究显示,Glu受体中的N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)与上述学习与记忆过程有关。NMDAR的多种功能主要取决于N-甲基-D-天冬氨酸受体2 (NR2) , NR2包括NR2A与NR2B, NR2B较NR2A有更好的生物学活性,与长时程增强电位(LTP)及脑缺血后的神经损伤都关系密切;NR2B的一个重要位点S1480的磷酸化,认为是其激活形式。NR2B活化,Ca2+瞬时内流,激活Ca2+相关蛋白激酶,如钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ (CaMKⅡ); NR2B与CaMKⅡ的相互作用进一步激活细胞外信号调节蛋白(ERK1/2)信号通路,并且ERK1/2信号通路能维持长期活化,诱导LTP [3]。酪蛋白激酶2 (CK2)是在体内广泛分布的酪/丝氨酸蛋白激酶,目前认为其功能与学习和记忆相关,CK2可以通过磷酸化NR2B的S1480位点,参与海马的学习和记忆功能[4]。越来越多的研究提示,运动增强海马神经元突触的可塑性(如长时程增强电位)是其提高学习和记忆能力的重要途径。本研究应用改良的双侧颈总动脉结扎(2-VO)的方法[5-15],腹腔注射硝普钠降压后,反复夹闭双侧颈总动脉,造成大鼠脑部持续缺血再灌注,制备VaD模型,以跑台运动作为运动方式,采用行为学检测、细胞形态学观察、免疫组化、聚合酶链式反应(PCR)、免疫印迹实验(Western Blot)等多角度、多层次的实验方法,观察了运动对VaD模型大鼠学习和记忆及海马神经细胞凋亡的影响,检测了海马部位NR1及NR2B基因的表达水平及CK2、p-NR2B、NR2B、p-ERK1/2、ERK1/2蛋白的表达,为运动干预治疗VaD提供了重要的实验依据。第一部分血管性痴呆大鼠模型的建立以及运动训练对大鼠行为学和海马病理学改变的影响随着医药科技的发展,每年都有治疗痴呆的新药物出现,但到目前为止,还没有任何一种被FDA批准为治疗VaD的药物上市。在脑卒中后,给予适度运动是一个很好的促进康复的治疗方案。目前,运动对学习和记忆的影响在运动人体科学领域处于研究的前沿和热点,运动对有关学习和记忆活动的诸多因素产生影响,其确切的生物学机制尚待进一步研究。在临床治疗实践中,运动干预策略作为VaD等脑血管病康复治疗的手段之一,其对认知功能恢复的效果甚至对脑血管病综合治疗的重要意义已被国际所接[16]。国内VaD的研究多集中于临床病例,以动物模型为研究对象的相对较少。因此,建立一种理想的动物模型,对VaD的病理机制研究以及临床治疗学的发展都有极大的促进作用。目的:建立合格的脑缺血再灌注VaD大鼠模型,研究运动训练是否会改变由VaD引起的学习和记忆障碍,并对其影响机制进行初步探讨,为运动干预治疗VaD提供实验依据。方法:本研究采用改良2-VO的方法,造成大鼠脑反复缺血再灌注损伤,制备VaD大鼠模型。以跑台训练作为运动方式,应用跳台实验、水迷宫实验检测大鼠的学习和记忆成绩,对VaD大鼠模型进行评估及评价运动训练对VaD大鼠学习和记忆能力的影响。应用焦油紫染色,观察大鼠海马组织神经细胞尼氏小体的变化及神经细胞的损伤状态。结果:1.跳台实验:各运动组与模型组大鼠10min内的犯错误次数和跳台停留时间相比较有统计学差异(P<0. 05),说明运动训练可以提高VaD大鼠的学习记忆成绩。2. Morris水迷宫实验:各运动组与模型组的逃生潜伏期、总游泳路程相比较有统计学差异(P<0. 05),说明运动训练可以提高VaD大鼠的学习成绩;Morris空间探索实验显示:各运动组与模型组在原象限停留的时间相比较有统计学差异(P<0. 05),说明运动训练可以提高VaD大鼠的空间定位及记忆成绩。3.海马CA1区细胞形态学变化焦油紫染色显示,运动4周和运动6周的大鼠,其脑海马神经细胞与模型组相比较排列明显整齐且神经细胞数量明显较多,细胞内尼氏小体数量较多,细胞凋亡明显减少。结论:1.模型组大鼠的学习记忆成绩明显下降,提示VaD大鼠模型制备成功。2.运动能够改善VaD大鼠学习和记忆能力,减轻海马CA1区神经细胞的损伤。第二部分运动训练对血管性痴呆大鼠学习记忆及海马部位CK2、NR1、NR2B、P-NR2B、ERK1/2、p-ERBK基因和蛋白表达的影响在脑卒中后,给予适度运动是一个很好的促进康复的治疗方案。临床实践资料显示,运动训练可以增强环境刺激,给予个体丰富的感知功能,使个体保持良好的意识状态,使患者的生活质量大幅提高;在健康的人群中进行体育运动训练能够使脑运动皮层区域的毛细血管密度增加,脑血流量加快。动物研究资料表明,脑卒中后及时进行积极的运动训练能促进动物运动功能恢复和提高动物的学习和记忆能力,其原因可能是减少了脑梗死的面积和缺血引起的神经细胞凋亡,分子生物学机制可能涉及运动能够提高脑源性生长因子(BDNF)和环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)等神经生长因子表达,使海马突触增生和密度增加,以及促进神经再生等[17-19]。越来越多的研究显示,运动增强海马神经元突触的可塑性(如长时程增强)可能是其提高学习和记忆能力的重要途径[20]。在此过程中,Glu及GluR可能扮演关键作用[21]。目的:探讨运动训练对神经细胞的保护作用及相关的分子机制,进而阐明VaD形成机制,为使用运动干预VaD的发展提供工作思路。方法:本研究采用改良2-VO的方法,造成大鼠脑组织反复缺血再灌注损伤,制备VaD大鼠模型,以跑台训练作为运动方式,通过PCR、western blot等方法,检测了 VaD大鼠海马部位NR1基因mRNA以及NR2B基因mRNA的表达及CK2、p-NR2B、NR2B、p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表达的变化。结果:1. PCR显示运动可以上调大脑海马部位NR1基因mRNA以及NR2B基因mRNA的表达水平,其在脑缺血再灌注3天(3d)模型组明显下降,与假手术组(Sham)比较有统计学差异。缺血再灌注运动4周(4w+s)组和缺血再灌注运动6周(6w+s)组与缺血再灌注4周(4w)组以及缺血再灌注6周(6w)组比较,表达量明显升高,有统计学意义(P<0. 05)。2. Western blotting:在3d组和2w组,海马部位CK2的密度值明显低于Sham组,有统计学意义(P<0.05)。随着观察时间的延长,CK2逐渐升高,在4w+s组,CK2表达最高。在2w+s组,4w+s组的表达与2w组和4w组相比明显升高,有统计学意义(P<0. 05); p-NR2B蛋白的表达随着时间及运动干预有增高趋势,p-NR2B/NR2B的密度值在4w+s组以及6w+s组的表达与2w组和4w组相比明显升高,有统计学意义(P < 0.05)。密度分析显示:p-ERK1/2蛋白表达的密度值在4w+s组以及6w+s组的表达与2w组和4w组相比明显升高,有统计学意义(P< 0. 05)。结论:运动训练通过上调海马NR1基因mRNA、NR2B基因mRNA的表达,上调NR2B、CK2蛋白的表达以及通过激活ERK1/2信号通路提高VaD大鼠的学习和记忆能力。