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精子冷冻是保存实验动物种质资源的有效手段,冷冻保存技术研究及冻精利用已成为一项迫切的研究任务,具有重要的研究意义和实用价值。大鼠精子冷冻保存迄今未获突破性进展,其冻精解冻后活力严重下降,难以用于常规的体外受精。本试验通过检测冷冻对精子结构的影响,为大鼠精子冷冻保存提供实验依据；在大鼠精子冷冻保存的基础上,以Piezc操作系统为支撑,利用大鼠冻精进行胞浆内单精注射研究,以期建立有效的大鼠胞浆内单精注射技术体系,提高大鼠冻精利用率1.超低温冷冻保存对大鼠精子结构与功能的影响本研究旨在优化大鼠精子冷冻保存方法,并利用荧光染色技术检测冷冻对精子结构与功能造成的影响。大鼠精子于5℃水浴平衡30 min,然后装入0.25 mL细管,液氮面上3 cm处平衡10 min投入液氮保存,采用37℃水浴解冻10s。实验表明,采用日本进口大鼠精子冷冻保护液所获冷冻结果较其他实验组结果好,解冻后精子活力为8.9%。低渗肿胀实验表明,大鼠精子质膜与小鼠、家兔的精子质膜存在一定差异；FDA-PI和AO染色发现,解冻后的精子质膜完整率和染色体完整率均接近100%;FITC-PNA染色发现冻精顶体完整率有所下降；RH123染色发现,解冻后精子线粒体受损严重,荧光染色出现分节或不着色现象。比较鲜精与冻精的体外受精,结果冻精体外受精率仅为17.5%,显著低于鲜精的体外受精率(75.3%；P<0.05)；将形态正常的2-细胞进行体外培养,两组的8-细胞发育率(11.1%对56.0%)和囊胚发育率(0对23.3%)差异显著(P<0.05)2.大鼠冻精的胞浆内单精注射研究本实验以piezo操作系统为技术支撑,系统比较注射针直径、采卵时间、操作液、PVP浓度和精子状态等对大鼠胞浆内单精注射的影响,并对不同品系大鼠进行ICSI研究,比较ICSI胚胎与IVF胚胎的卵裂与发育情况。(1)用直径为7～10μm和2～4μm注射针进行大鼠ICSI操作,所获卵母细胞存活率(30.5%对61.3%)和卵裂率(12.5%对51.1%)均差异显著(P<0.05)；较小直径的注射针更有利于ICSI操作。(2)在注射hCG后14、16和18h采卵作ICSI,3组存活率(77.4%和74.1%对69.6%)差异不显著(P>0.05),但18h组的卵裂率显著低于14和16h组(31.3%对60.8%和56.0%；P<0.05),说明14～16h后采卵进行ICSI最合适。(3)用不同的显微操作液Hepes-mR1ECM和Hepes-mKRB进行大鼠ICSI,卵存活率相近(79.2%对75.9%),卵裂率(70.5%对75.0%)差异不显著(P>0.05),但囊胚发育率(21.2%对35.1%)差异显著(P<0.05),在显微操作液中添加3%蔗糖后结果无明显改善。(4)精子操作液中不添加PVP时,卵存活率和卵裂率均高于5%、10%浓度组,可见不添加PVP的精子操作液更有利于注射卵的发育。(5)用不同状态精子进行ICSI,结果显示,超声处理精子与无超声处理对照组之间的卵裂率差异显著,超声处理有利于ICSI胚胎的发育。mKRB组精子的卵裂率要高于冷冻保护剂冻精组,且与鲜精组相近(78.9%和79.8%对77.6%),说明不受冷冻保护剂保护的冷冻精子仍然具有受精能力。(6)由于遗传背景不同,Wistar和F344、SD的卵裂率(50.6%对74.0%、68.4%)差异显著,F344和SD相比,则差异不显著。(7)冻精IVF的卵裂率(17.5%对63.6%、75.3%、68.3%)、8-细胞发育率(11.1%对48.6%、56.0%、49.3%)和囊胚率(0%对22.9%、23.3%、21.7%)均显著低于其他3组；冻精ICSI的卵裂率和胚胎发育率与鲜精IVF、ICSI无显著性差异(P>0.05)。(8)挑选形态良好的2-细胞分别进行体外培养和胚胎移植,结果ICSI胚胎4-细胞发育率(69.5%对87.9%)、8-细胞发育率(48.6%对60.7%)与体内受精胚胎差异显著,但桑椹胚发育率(34.2%对38.3%)和囊胚发育率(22.9%对29.9%)差异不显著。大鼠ICSI胚胎经移植后产下仔鼠,表明本实验初步成功建立了SD大鼠的ICSI操作技术和方法。