胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GB）是一种具有高度异质性和侵袭性的原发恶性脑肿瘤,中位生存时间约14.6个月。GB的标准治疗方案为肿瘤最大范围切除后,联合放射治疗和或替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）化疗。与单独放疗相比,TMZ可提高GB患者的总生存期和无进展生存期,但TMZ长期应用易产生耐药性,从而限制其疗效。鉴于GB的高致死性及对传统疗法的相对抵抗,使得深入探究与GB治疗相关的深层机制具有重要意义。已有证据表明替莫唑胺治疗可激活自噬,自噬是一个溶酶体介导的动态膜融合过程,并且自噬在肿瘤发生的不同阶段扮演重要作用。依赖于肿瘤类型和周围环境的不同,自噬发挥着双重作用,既具有肿瘤促进也具有肿瘤抑制的特性。GB经TMZ治疗时,自噬作为压力应激反应被频繁激活,并循环降解细胞内容物来维持细胞代谢和生物合成,因此自噬被认为是一个对烷基化化疗药物抵抗的机制。在GB中,联合自噬抑制剂如巴佛洛霉素A1（Bafilomycin A1,Baf-A1）和氯喹（Chloroquine,CQ）可以增加TMZ治疗GB的敏感性,但临床实验结果表明自噬抑制剂联合TMZ并没有显著提高GB患者的总生存期,这提示自噬的作用可能具有环境依赖性。此外,在包括GB在内的各种肿瘤中,自噬的多种作用被广泛报道,因此新型的自噬机制在肿瘤治疗中的作用引起了极大关注。新近的研究揭示某些特定的无前导序列蛋白需要自噬泡膜结构包裹介导其出胞,这一过程称为分泌型自噬（Secretory autophagy）。分泌型自噬在介导蛋白转运与出胞过程的作用被认为是自噬机制的一种特殊功能,它将胞内蛋白的直接影响范围扩展到胞外微环境。最近在这一领域的一项重要突破是鉴定了一组非常规分泌的胞质蛋白,这些缺乏前导肽序列的蛋白不能进入由高尔基体到内质网的常规分泌途径,例如高迁移率族蛋白B1（High mobility group box 1,HMGB1）、白介素18（Interleukin-18,IL-18）、白介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）等。我们既往在乳腺癌中证明由肿瘤相关成纤维细胞自噬性分泌的HMGB1对于乳腺癌的进展发挥了关键作用,因此提示HMGB1在肿瘤中作用重要。HMGB1是高度保守的染色质蛋白,并且基于其细胞定位不同发挥不同的生物学功能,当其定位于胞内时,HMGB1可维持核小体的动态与染色质的稳定,参与DNA的修复和端粒的稳定。但当其位于胞外时,HMGB1可以与多个受体相互作用,发挥细胞因子和趋化因子的作用调节炎症和免疫过程。胶质瘤中的HMGB1被报道可以通过激活下游通路如NF-κB,IRF3和PI3K产生功能性的免疫反应,激活下游的肿瘤相关树突细胞、CD8+T细胞和巨噬细胞。除此之外,在骨髓源性巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages,BMDM）中的HMGB1可以通过其受体RAGE激活NFκB依赖的炎症反应。GB中丰富的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）浸润是其典型特征,但这些TAMs缺乏明显的吞噬活性,新近的研究表明,肿瘤微环境中的TAMs基于其自身的极化状态可分为M1与M2两种状态,M1样TAMs对肿瘤细胞发挥杀伤毒性作用,引发肿瘤破坏性的免疫反应,而M2样TAMs通常具有免疫抑制作用,促进GB的恶性生物学行为。因此TAMs在肿瘤宿主免疫反应与肿瘤进展中发挥关键作用,并且肿瘤细胞释放的细胞因子能够调节M1与M2样TAMs的极化状态。然而,GB在经TMZ治疗时,分泌型自噬介导的细胞因子出胞是如何影响肿瘤对化疗制剂的敏感性这一关键过程未知,因此我们的研究提出了一种新颖的观点认为,GB经TMZ治疗时,分泌型自噬过程被激活并介导HMGB1的出胞使肿瘤微环境中的TAMs向M1样极化可提高TMZ的化疗敏感性。主要的结果、结论如下:一.替莫唑胺诱导HMGB1的出胞依赖于分泌型自噬。1.1 ELISA检测经TMZ处理的GB细胞系及原代细胞中已知的无前导序列蛋白的分泌情况,结果显示HMGB1是唯一的分泌水平明显增加的分泌型自噬蛋白。1.2 qPCR检测TMZ处理后核心自噬基因的表达,结果显示ATG5、ATG7、LC3B和BECN1 mRNA表达水平显著增加。1.3构建mRFP-GFP-LC3B双标荧光腺病毒载体检测自噬体形成及自噬流的活化,结果显示TMZ明显激活自噬过程,使得胞内HMGB1减少,胞外HMGB1增多。1.4使用自噬抑制剂（3-MA,LY294002）或敲低自噬相关关键基因（si ATG5,si GORASP2）干扰自噬囊泡形成,结果显示在TMZ处理下HMGB1的出胞显著减少。二.胞外HMGB1可作为胶质母细胞瘤患者替莫唑胺治疗的预测标记物。2.1分析HMGB1在TCGA数据库中不同数据集中的表达情况,结果显示相较于非肿瘤组织与低级别胶质瘤组织,HMGB1在GB中表达水平显著增加,并与生存预后相关,表达水平越高则患者预后越差。2.2免疫组化染色41例配对的GB组织样本HMGB1并评分,结果表明经TMZ治疗后其胞内定量免疫组化评分显著降低。2.3检测TMZ治疗前后配对GB样本血清中HMGB1的水平,结果表明TMZ治疗后血清中HMGB1水平升高的患者有较好的生存预后。2.4免疫组化染色LC3B,SQSTM1/p62,STX17和HMGB1进一步明确自噬活性与HMGB1表达的相关性,定量免疫组化评分显示胞内自噬活性与HMGB1含量呈负相关。三.胶质母细胞瘤中的肿瘤相关巨噬细胞高表达HMGB1受体。3.1分析GEO数据库中的单细胞测序数据集发现,HMGB1的已知受体TLR2、TLR4、TLR9、RAGE主要定位于肿瘤相关巨噬细胞（Tumor associated macrophages,TAMs）表面。3.2免疫荧光染色GB组织证实TLR2、TLR4、TLR9、RAGE主要定位于TAMs表面。四.HMGB1通过RAGE促进胶质母细胞瘤中肿瘤相关巨噬细胞M1样极化。4.1免疫共沉淀（Co-IP）结果显示,在THP1与RAW264.7巨噬细胞中HMGB1与其受体RAGE的亲和力最高。4.2荧光素标记外源性HMGB1处理THP1与RAW264.7巨噬细胞,免疫荧光结果显示HMGB1与细胞膜表面RAGE受体结合随时间延长而增多。4.3 qPCR与Western blot检测外源性HMGB1处理THP1与RAW264.7巨噬细胞后RAGE含量的变化,结果显示其表达量显著增加。4.4外源性HMGB1处理巨噬细胞,结果表明其显著上调巨噬细胞的M1样相关基因表达量,并抑制M2样相关基因表达量。4.5基因转染构建稳定敲除HMGB1的GB细胞株sh Hmgb1-GL261构建原位移植瘤模型,经TMZ治疗后其极化M1型TAM的能力显著降低。五.HMGB1诱导肿瘤相关巨噬细胞M1样极化提高替莫唑胺敏感性。5.1构建原位移植瘤小鼠模型,静脉给与鼠源性HMGB1重组蛋白并腹腔给与TMZ,结果表明联合治疗组小鼠生存期显著延长。5.2免疫荧光染色显示,TMZ联合HMGB1组有更高比例M1样巨噬细胞。5.3免疫荧光染色肿瘤细胞增殖相关抗原（Ki67）和细胞凋亡相关抗原（Cleaved caspase-3）,TMZ联合HMGB1组显示出较低的Ki67比例与较高的Cleaved caspase-3比例;并在人胶质母细胞瘤组织样本中发现,HMGB1表达丰富的区域高表达Cleaved caspase-3。六.HMGB1通过激活RAGE-NFκB-NLRP3炎性小体通路促进肿瘤相关巨噬细胞M1样极化。6.1检测HMGB1处理巨噬细胞后上清中的细胞因子,结果表明M1相关的炎性因子显著升高,且RAGE特异性抑制剂FPS-ZM1与炎性小体特异性抑制剂CY-09显著抑制了炎性因子的升高,表明HMGB1通过RAGE和炎性小体活化M1样巨噬细胞。6.2 Western blot检测RAGE下游通路,发现ERK1/2、IKB、NFκB的磷酸化水平显著提高,表明HMGB1通过激活RAGE-NFκB-NLRP3炎性小体通路促进TAMs的M1样极化。6.3免疫荧光染色显示,HMGB1高表达的区域,M1样TAMs分泌的相关炎性因子高表达,且炎性小体关键组分也高表达。