【研究背景和目的】心肌纤维化是心脏重塑过程的重要事件,是多种心脏疾病病理基础的组成部分。它以细胞外基质异常升高为特征,导致组织顺应性降低、心功能受损,从而加速心力衰竭的发展。越来越多的证据表明泛素-蛋白酶体参与调控了心肌纤维化,而USP2作为去泛素化酶的其中一种,可以去除底物上的泛素来逆转靶蛋白降解,并调控许多细胞过程,如调控细胞周期和多种信号通路。本研究探讨了去泛素化酶USP2在心肌纤维化中所扮演的角色,证明了抑制去泛素化酶USP2可促进β-catenin的降解从而减轻心肌纤维化,为心肌纤维化提供了潜在的治疗靶点。【研究方法】1.为了研究USP2在心肌纤维化中的作用,在心脏成纤维细胞（CFs）中加入2μmol/L的Ang Ⅱ以建立心肌纤维化的细胞模型。实验分为两组,分别为空白组和Ang Ⅱ模型组。利用Western blot技术检测CFs中纤维化相关的标志蛋白（Collagen III、CTGF、Periostin）以及靶蛋白USP2的表达情况。2.为了研究USP2对心脏成纤维细胞增殖和迁移的影响,本研究使用sh-USP2和不同浓度的USP2的抑制剂ML364处理被Ang Ⅱ激活的CFs,利用MTS法检测CFs的细胞活力。选取合适的ML364药物浓度进行后续的实验,实验分组为:Con组、Ang Ⅱ组、Ang Ⅱ+ML364组、ML364组、sh-NC组、Ang Ⅱ+sh-NC组、Ang Ⅱ+sh-USP2组、sh-USP2组。利用Ed U细胞增殖试验和划痕试验,研究CFs在Ang Ⅱ作用下的增殖和迁移情况,以及抑制USP2后的逆转情况。3.为了研究USP2对心脏成纤维细胞周期的影响,本研究采用Western blot和流式细胞术研究在USP2被ML364抑制或不被抑制的情况下,周期蛋白的表达情况以及细胞周期的变化。研究分为四个组:Con组、Ang Ⅱ组、Ang Ⅱ+ML364组、ML364组。4.为了研究USP2对心肌纤维化形成的影响,本研究在心肌纤维化的细胞模型上,采用不同处理去抑制USP2（抑制剂ML364和sh-USP2）,检测纤维化相关的标志蛋白的表达。5.为了研究USP2是否调控心脏成纤维细胞β-catenin的表达,本研究利用Western blot检测ML364和sh-USP2处理前后的心脏成纤维细胞的β-catenin的蛋白表达情况,以及采用激光共聚焦显微镜观察在使用了ML364抑制USP2后β-catenin在细胞内的表达情况。6.为了研究β-catenin蛋白水平是否通过泛素-蛋白酶体系统调控,本研究使用蛋白酶体抑制剂MG132进行β-catenin蛋白水平逆转实验。7.为了研究USP2与β-catenin之间的相互作用,本研究采用免疫共沉淀实验检测Ang Ⅱ处理前后的心脏成纤维细胞,并对泛素化后的β-catenin采用Western blot进行定量检测。【研究结果】1.Western blot结果显示,USP2在Ang Ⅱ诱导的心肌纤维化中表达增加。2.MTS结果显示,ML364在合适的浓度下可以有效降低细胞活力,敲低USP2也抑制了CFs的活力;Ed U细胞增殖实验结果显示,抑制USP2可以抑制CFs的增殖;细胞划痕实验结果显示,抑制USP2可以阻碍CFs的迁移。3.流式细胞术结果显示,ML364在G0/G1期阻滞了心脏成纤维细胞周期的进展;Western blot结果显示,在使用抑制剂ML364以后,细胞周期蛋白Cyclin D1表达降低,P27蛋白表达升高。4.Western blot结果显示,Ang Ⅱ明显增加了CFs中USP2的蛋白表达水平,同时,纤维化的相关蛋白,包括Collage III、结缔组织生长因子CTGF和骨膜蛋白（Periostin）的表达也明显上调。而这些蛋白水平的高表达可以被ML364和sh-USP2所抑制。5.Western blot结果显示,Ang Ⅱ在激活CFs和上调USP2蛋白水平的同时也激活了Wnt/β-catenin通路,促进了GSK-3β磷酸化,也显著提高了β-catenin蛋白的水平。然而,ML364可以逆转这些效应,使Wnt/β-catenin信号失活。敲低USP2得到的实验结果也跟ML364的相同。免疫荧光的实验结果也与western blot的相一致。6.Western blot结果显示,抑制USP2可以降低β-catenin的蛋白表达水平,而加入蛋白酶体抑制剂MG132后,β-catenin的蛋白表达水平得到升高。7.免疫共沉淀结果显示,USP2可以与β-catenin相互作用,而且Ang Ⅱ的作用不影响它们的相互作用;抑制USP2显著增加了β-catenin泛素化水平,支持USP2作为β-catenin的一个去泛素化酶,能够逆转其泛素化,从而稳定β-catenin蛋白。【结论】去泛素化酶USP2通过稳定β-catenin调控AngⅡ诱导的心肌纤维化。