【摘 要】
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目的:探讨orexin-A对脊髓腹角神经元甘氨酸受体（glycine receptor,GlyR）的作用及其机制。方法:本实验选用7～12天的新生Sprague Dawley（SD）大鼠,雌雄不拘。麻醉后,快速轻柔地分离出含腰骶膨大部的脊髓,借助震荡切片机切取400～500μm厚度的切片若干,用木瓜蛋白酶（Papain,0.18 g/30 mL人工脑脊液）消化20～30 min后,将切片移入新鲜常
【基金项目】
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国家自然基金项目（31200828,31271155）； 安徽省高校自然科学研究项目（KJ2019A0411,KJ2018A0266）； 安徽省高校优秀青年人才支持计划项目（gsyqZD2016175,gxyq2017034）； 皖南医学院博士科研启动基金（rcqd201609）；
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目的:探讨orexin-A对脊髓腹角神经元甘氨酸受体（glycine receptor,GlyR）的作用及其机制。方法:本实验选用7～12天的新生Sprague Dawley（SD）大鼠,雌雄不拘。麻醉后,快速轻柔地分离出含腰骶膨大部的脊髓,借助震荡切片机切取400～500μm厚度的切片若干,用木瓜蛋白酶（Papain,0.18 g/30 mL人工脑脊液）消化20～30 min后,将切片移入新鲜常温的ACSF中孵育40～60 min。在显微镜下观察脊髓切片的形态,以中央管为界取其腹侧,用自制的不同口径大小的巴斯德吸管进行轻柔的机械吹打,直至将脊髓组织块基本解离成细胞悬液,静置10～20 min待细胞贴壁,将培养皿置于荧光倒置显微镜下进行电生理记录。结果:1.脊髓腹角神经元形态学观察急性分离的脊髓腹角神经元状态良好,形态完整且具有多样性,突起较多且有分支。2.脊髓腹角神经元的基本电生理参数本实验共记录到10例脊髓腹角神经元的自发放电,其放电频率连续而稳定,基本上均有超射,其基本电生理参数与实验室前期研究基本一致。3.Orexin-A对脊髓腹角神经元甘氨酸电流的作用在实验记录到的66例脊髓腹角神经元中,给予100 nmol/L orexin-A预处理2min后,可显著增大甘氨酸电流,并稳定至对照电流的171.53±40.46%（P<0.01）。4.OX1R介导orexin-A对甘氨酸电流的增大作用在实验记录到的14例细胞,先给予100 nmol/L orexin-A增大甘氨酸电流至对照电流的176.21±25.91%（P<0.01）,而后应用10μmol/L SB334867[orexin-1受体（OX1R）选择性拮抗剂]预处理2 min后,可以完全取消orexin-A增大甘氨酸电流的效应,为对照电流的100.90±1.75%（P>0.05）。在另7例细胞,当100 nmol/L orexin-A增大甘氨酸电流至对照电流的166.40±39.87%（P<0.01）后,给予10μmol/L TCSOX229[orexin-2受体（OX2R）选择性拮抗剂]预处理2 min后,orexin-A仍能增大甘氨酸电流至对照电流的164.05±40.53%（P<0.01）。5.Ca2+参与orexin-A增大甘氨酸电流的作用在无钙细胞外液中,给予100 nmol/L orexin-A预处理2 min后,orexin-A对甘氨酸电流的增大作用不受影响,电流幅值为对照电流的168.95±31.55%（n=7,P<0.01）;当胞内给予Ca2+螯合剂BAPTA（10 mmol/L）,应用100 nmol/L orexin-A预处理2 min后,orexin-A不能增大甘氨酸电流,电流幅值为对照电流的102.35±6.99%（n=11,P>0.05）。当胞内给予IP3受体拮抗剂肝素（5 mg/mL）,给予100 nmol/L orexin-A预处理2min后,orexin-A增大甘氨酸电流的作用消失,电流幅度为对照电流的98.52±3.77%（n=8,P>0.05）;胞内给予另一种IP3受体拮抗剂Xe-C（20μmol/L）时,也得到了相似的结果,orexin-A对甘氨酸电流的增大作用消失,电流幅度为对照电流的100.21±0.50%（n=5,P>0.05）。而当胞内给予ryanodine受体拮抗剂ryanodine（50μmol/L）,给予100 nmol/L orexin-A预处理2 min后,orexin-A仍显著增大甘氨酸电流至对照电流的175.43±32.91%（n=9,P<0.01）。6.PKC参与orexin-A对甘氨酸电流的增大作用胞内给予PKC选择性拮抗剂Bis-IV（10μmol/L）,可完全取消100 nmol/L orexin-A对甘氨酸电流的增大作用,电流幅度为对照电流的100.65±2.02%（n=17,P>0.05）;此外,在PKC选择性激动剂PMA（1μmol/L）存在的情况下,orexin-A亦不能进一步增大甘氨酸电流幅度（n=5,P>0.05）。7.PKA不参与orexin-A对甘氨酸电流的增大作用胞内给予PKA拮抗剂Rp-c AMP（50μmol/L）,orexin-A仍能显著增大甘氨酸电流,为对照电流的177.02±21.31%（n=6,P<0.01）。结论:利用酶消化联合急性机械分离法,分离出的脊髓腹角神经元形态完整,状态良好,适用于膜片钳记录。Orexin-A通过与脊髓腹角神经元的OX1R结合,激活胞内IP3/Ca2+/PKC信号通路,从而增大脊髓腹角神经元的甘氨酸电流。
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