【摘 要】
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蛋白质的翻译后修饰,如磷酸化和糖基化等在生物学过程起着重要的调控作用,对于推动和深入开展蛋白质组学研究具有极其重要的意义。由于生物样品酶解液中糖肽及磷酸肽的丰度低、非特异性蛋白干扰严重等,采用质谱技术对其直接进行分析十分困难,所以非常有必要在分析前采用高效的分离富集技术。针对现有的亲水相互作用色谱（HILIC）及固定化金属离子亲和色谱（IMAC）吸附剂的制备过程存在操作复杂、需要多步修饰、耗时、不
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蛋白质的翻译后修饰,如磷酸化和糖基化等在生物学过程起着重要的调控作用,对于推动和深入开展蛋白质组学研究具有极其重要的意义。由于生物样品酶解液中糖肽及磷酸肽的丰度低、非特异性蛋白干扰严重等,采用质谱技术对其直接进行分析十分困难,所以非常有必要在分析前采用高效的分离富集技术。针对现有的亲水相互作用色谱（HILIC）及固定化金属离子亲和色谱（IMAC）吸附剂的制备过程存在操作复杂、需要多步修饰、耗时、不适用于大规模制备等问题,迫切需要开发出制备过程简便的新方法。本论文采用反相悬浮聚合法制备了2种大孔吸附树脂微球,分别应用于复杂生物样品中N-糖肽和磷酸化肽分离富集,具体如下:1.利用3-[N,N-二甲基-[2-（2-甲基丙基-2-氧基）乙基]铵]丙烷-1-磺酸盐（MSA）及N,N-亚甲基双丙烯酰胺（BIS）为前驱体,采用反相悬浮聚合法一步制备了一种新型的含两性离子基团的微球。通过考察制备条件,包括总单体含量、MSA/BIS比例、水/油比、稳定剂含量等因素对微球形成的影响,所制备的多分散微球粒径范围为15～25μm,比表面积达到138 m~2/g。由于该两性离子微球亲水性好,可以直接作为HILIC吸附剂,从10μg的Ig G酶解液中富集了19个N-糖肽,此外通过c LC-MS/MS从2μL人血清酶解液中鉴定到383个N-糖肽和224个N-糖基化位点。结果表明采用“一步法”合成的两性离子亲水微球具有良好的富集性能,并且适用于大规模制备。2.以乙烯基膦酸为功能单体,BIS为交联剂,通过反相悬浮聚合一步合成富含磷酸根的多分散微球。由于功能单体中含有磷酸基,所制备的富含磷酸根的多分散微球不仅直接表现出对糖肽的亲水富集的特性,而且可以与钛离子(Ti4+)螯合作为Ti4+-IMAC吸附剂,对磷酸肽进行选择性富集,可以从5μL的巴氏杀菌奶酶解液中鉴定出113个磷酸化肽,归属于25个磷酸化蛋白,结果表明微球表现出良好的捕获磷酸化肽的性能。与其他IMAC合成方法相比,该方法操作简单、节省时间,具有良好的商业化前景。
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