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苜蓿是世界上栽培历史最悠久,应用分布广,最经济的牧草饲料,但为了满足生产发展的需要,改良牧草遗传特性,创造符合需求的优良品种成为长久不衰的课题。植物原生质体融合技术是克服远缘杂交困难、有性杂交不亲和扩大遗传变异的一种有效手段,为改良苜蓿抗性、产量和品质提供新途径。本试验以具有抗寒耐旱的俄罗斯杂花苜蓿(Medicago sativa subsp. Varia)和抗逆性不足的甘农4号紫花苜蓿(Medicago sativa L. cv. Gannong No.4)为试验材料,研究不同激素配比对愈伤组织诱导、分化及再生体系的影响；同时在此基础上研究酶液组合、渗透压调节物、酶解时间、激素及培养密度等因素对其愈伤组织原生质体分离、培养的影响；并对二种苜蓿的原生质体非对称融合的细胞失活处理、电场条件、融合密度等影响因素进行研,为进一步对苜蓿及其他牧草种间体细胞融合的研究奠定基础,也是本研究的主要目的之一。试验结果表明：1.俄罗斯杂花苜蓿子叶愈伤组织诱导最佳培养基为：MS+1.0mg·L-12,4-D+1.0mg·L-16-BA+1.0mg·L-1NAA,出愈率达91.1%；下胚轴愈伤组织诱导最佳培养基为：MS+1.0mg·L-12,4-D+0.5mg·L-16-BA+0.5mg·L-1KT,出愈率达93.3%；甘农4号紫花苜蓿子叶和下胚轴愈伤组织诱导最佳培养基均为MS+2.0mg·L-12,4-D+1.5mg·L-16-BA++1.5mg·L-1NAA,出愈率分别为88.9%和92.2%。2.俄罗斯杂花苜蓿愈伤组织的最佳分化培养基为：MS+0.5mg· L-1KT+0.3mg·L-1NAA,子叶、下胚轴愈伤组织的分化率分别达91.1%,83.3%；甘农4号紫花苜蓿愈伤组织的最佳分化培养基为MS+0.5mg·L-1KT+0.5mg·L-1NAA,子叶、下胚轴愈伤组织的分化率分别达88.9%,82.2%；3.俄罗斯杂花苜蓿和甘农4号紫花苜蓿分化苗的最佳生根培养基均为：1/2MS+1.0mg·L-1IBA,生根率分别为96.7%和86.7%。4.俄罗斯杂花苜蓿下胚轴愈伤组织继代培养至14d时的游离性最佳,最适酶液组合为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%离析酶,最佳渗透压为0.55mol—L-1甘露醇,最佳酶解时间为12h,最适预处理措施为CPW-11溶液质壁分离1h,在此最佳酶解条件下,俄罗斯杂花苜蓿下胚轴愈伤组织的原生质体产量和活力可达3.40×106个·g-1和73.1%；5.甘农4号紫花苜蓿下胚轴愈伤组织继代培养至12d时的游离性最佳,最适酶液组合为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%半纤维素酶,最佳渗透压为0.6mol—L-1甘露醇,最佳酶解时间为10h～12h,最适预处理措施为CPW-11溶液质壁分离1h,在此最佳酶解条件下,甘农4号紫花苜蓿下胚轴愈伤组织的原生质体产量和活力可达3.34×106个·g-1和82.8%;6.俄罗斯杂花苜蓿下胚轴愈伤组织分离所得原生质体在固-液综合培养时,最适激素组合为1.5mg·L-2,4-D+1.0mg·L-16-BA,最适原生质体培养密度为3×105个·ml-1,此时细胞分裂频率可达36.3%,褐化程度轻,易形成结构致密、可持续分裂的细胞团。7.甘农4号紫花苜蓿下胚轴愈伤组织分离所得原生质体在固-液综合培养时,最适激素组合为2.0mg·L-12,4-D+1.0mg·L-16-BA,最适原生质体培养密度为3×105个·ml-1,此时细胞分裂频率可达37.9%,褐化程度轻,易形成结构致密、可持续分裂的细胞团。8,在融合前失活预处理中,俄罗斯杂花苜蓿原生质体在紫外灯下辐射5min是使其细胞核失活的最适条件；甘农4号紫花苜蓿原生质体经6mmol·L-IOA钝化处理是使其细胞质失活的最适条件；9.俄罗斯杂花苜蓿原生质体与甘农4号紫花苜蓿原生质体电融合的最适条件为：双亲原生质体密度范围均为3×105个·ml-1-5×105个·ml-1,交流电场强度为15V·cm-1～20V·cm-1,交流电场频率为2000kHz～2500kHz,直流脉冲场强为200V·cm-1～250V·cm-1,脉冲宽幅为40μs,直流脉冲3次,此时有效融合率可达13.8%。