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目的:
1、通过免疫组化方法半定量研究Smad2,3,4,7蛋白及TGF-β<,1>蛋白在慢性移植性肾病和正常肾组织中的定位和表达变化。
2、比较分析Smad2,3,4,7蛋白和TGF-β<,1>蛋白之间及其与依据BANFF 97标准的CAN病理分级间的关系。
3、探讨TGF-β/Smads信号转导通路与CAN移植肾纤维化存在的内部联系及调控机制。
4、阐述Smad通路在CAN中导致肾移植物纤维化的发病机制,并为开辟防治慢性移植性肾病的新途径提供理论和实验依据。
方法:
1. 标本收集
收集南方医院2002年9月-2005年6月间13例经组织病理学和临床上明确诊断为CAN并行移植肾切除的肾标本作为实验组;取10例正常肾组织作为对照组。
2. HE染色
2.1.根据移植肾Banff 97病理诊断分类标准将13例肾移植标本进行病理诊断和分级。
2.1.1. CAN Ⅰ级轻度间质纤维化和肾小管萎缩伴或不伴有慢性排斥反应的特异改变。
2.1.2. CAN Ⅱ级中度间质纤维化和肾小管萎缩伴或不伴有慢性排斥反应的特异改变。
2.1.3. CAN Ⅲ级重度间质纤维化和肾小管萎缩、消失伴或不伴有慢性排斥反应的特异改变。
2.2. 再根据病理诊断和分级将实验组细分为CANⅠ级组、CAN Ⅱ级组和CAN Ⅲ级组,由于标本量不足合并CAN Ⅰ级组和CAN Ⅱ级组为同一组。
3. 免疫组化染色(SP法)用免疫组化法检测Smad2、Smad3、Smad4、 Smad7和TGF-β1蛋白的定位和表达变化。
4. 图像分析方法图像半定量分析肾小球和肾小管间质中Smads蛋白和TGF-β1的含量变化。采用武汉千屏公司HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统,通过光学显微镜放大200倍摄取图像并分析。每例随机分析10个视野的正切肾小球和肾小管间质,每例肾小管总数大于70个.用半定量法测定所选视野中的免疫组化阳性信号面密度,取其均值代表该成分在肾小球或肾小管间质中的相对含量.
5. 统计学方法采用SPSS 10.0软件包进行统计学分析,TGF-β<,1>和Smads蛋白在肾小球中组化阳性表达的变化比较采用Kruskal-Wallis检验,两两关系采用Spearman法TGF-β<,1>和Smad蛋白在肾小管间质中组化染色的变化比较采用组间方差分析,两两比较采用SNK法,两两关系采用Pearson法。以P<0.05有统计学意义,以P<0.01有高度统计学意义。
结果:
1. CAN组织病理学改变通过对13例CAN移植肾组织常规HE染色观察,CAN组织病理学主要表现为肾小球萎缩、纤维化、玻璃样变;肾内小动脉内膜向心性纤维性增殖,部分管腔狭窄或闭塞;肾小管萎缩,排列较紊乱,部分髓质的集合管扩张,蛋白管型常见;间质纤维化伴有明显的淋巴细胞、浆细胞浸润。
2. CAN病理分级结果13例CAN移植肾组织中,按照移植肾Banff 97病理诊断分类标准诊断为CAN。Ⅰ级的有2例,Ⅱ级5例,Ⅲ级6例。
3.正常肾组织中TGF-β<,1>和Smads蛋白的表达正常肾组织中TGF-β<,1>、Smad2/3和Smad4蛋白着色主要位于肾小管上皮细胞胞浆中,多呈弱阳性表达,肾小球、肾间质及鲍曼囊壁、脏层上皮细胞偶见阳性信号表达;而Smad7蛋白着色主要位于肾小球和鲍曼囊壁、脏层上皮细胞,多呈强阳性信号表达,肾小管上皮细胞有少许表达。
4. CAN移植肾组织中TGF-β<,1>、Smad2/3和Smad4蛋白的表达与正常肾组织相比,TGF-β<,1>、Smad2/3和Smad4蛋白在CAN移植肾组织中肾小球和肾小管上皮细胞的胞浆、胞核中多呈阳性表达,移植肾CANⅢ级呈强阳性表达;肾问质可见散在阳性信号分布,大部分肾小球鲍曼囊壁、脏层上皮细胞亦有阳性信号表达。并随着移植肾的CAN病理分级加重,TGF-β<,1>、Smad2/3和Smad4蛋白在移植肾组织中表达逐渐增强。
5. CAN移植肾组织中Smad7蛋白的表达与正常肾组织相比,Smad7蛋白着色主要在CAN移植肾组织中的肾小球,多呈弱阳性表达,肾小管上皮细胞可见散在阳性信号表达,肾间质和肾小球鲍曼囊壁、脏层上皮细胞偶见阳性信号表达。并随着移植肾的CAN病理分级加重Smad7蛋白在移植肾组织中表达逐渐减弱。
6. 统计学分析Smad2、Smad3和Smad4主要在正常肾组织的肾小管上皮细胞内表达,肾小球偶见;而Smad7主要在肾小球表达。与对照组相比,Smad2、Smad3和Smad4蛋白在CAN中肾小球和肾小管上皮细胞的表达均明显增加(P<0.01、r<,sg2/3>=0.998、r<,sg4>=0.996、r<,2/3>=0.998、r<,4>=0.992),与TGF-β<,1>上调成正相关;而Smad7蛋白在肾小球中的表达却明显下降(P<0.01),与TGF-β<,1>上调成负相关(r<,s>=-0.868)。并且随着CAN的加重Smad2,3,4蛋白的表达逐渐增加,而Smad7蛋白的表达逐渐减少(P<0.01)。
结论:TGF-β/Smad信号转导通路参与了CAN的肾小球硬化和肾间质纤维化进程,Smad2、3、4蛋白过度表达和Smad7负调控不足是导致CAN肾小球硬化和肾间质纤维化的主要原因。