脂肪酶是一种高效的生物催化剂,在制药、食品和精细化工等不同工业领域有着广泛的应用。但脂肪酶通常无法满足工业生产中所要求的高活性、稳定性以及可循环使用性。为满足工业生产需求,需寻求一种简单、快捷、有效的固定化方法来提高脂肪酶的应用范围。为获得性质优良的脂肪酶以及可循环使用的脂肪酶,本研究合成了古细菌嗜热玫瑰红球菌来源的脂肪酶基因,利用基因工程技术在毕赤酵母中异源表达脂肪酶基因,并且对脂肪酶进行了一系列的固定化以期提高其酶活与稳定性。主要研究内容和结果如下:（1）古细菌嗜热玫瑰红球菌（Thermomicrobium roseum）脂肪酶在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的异源表达。构建重组表达载体p Pic9k,通过电转化的方式将脂肪酶基因整合至毕赤酵母GS115染色体基因组中;通过浓度由低到高(0.5～4 mg·m L-1)的遗传霉素平板筛选含有不同脂肪酶基因拷贝数的阳性转化子,共得到8株菌。为确定这8株菌基因组中的拷贝数,分别构建了内参基因与脂肪酶基因的标准质粒PT-GAPDH和PT-lip。随后,利用RT-q PCR建立拷贝数与Ct值的标准曲线,经测量这8株菌基因组中脂肪酶基因的拷贝数从2～26个不等。将这八株菌分别诱导发酵测量相应脂肪酶酶活,最终得出结论:毕赤酵母基因组中脂肪酶基因拷贝数为13个时,酶活最高达到0.0284 U·m L-1。将上述菌株进行诱导发酵,经镍柱亲和层析后,SDS-PAGE显示蛋白条带单一与理论分子量36.4 k Da相符,脂肪酶的比酶活为1.05 U·mg-1。再进一步通过对发酵时间、培养基初始p H、诱导温度、甲醇浓度分别进行优化后,最终在培养基初始p H 8.0、诱导温度为30℃、每24 h添加2%的甲醇,诱导发酵108 h的条件下,测得发酵液上清液酶活为0.226 U·m L-1,相较于发酵前酶活提升了3.3倍。（2）嗜热脂肪酶-无机杂化纳米花的制备及性能研究。本研究采用声化学方法,10 min内将脂肪酶固定于由磷酸铜沉淀所构成的无机杂化纳米花中,并进一步通过SEM、XRD和FT-IR等技术对制备的脂肪酶杂化纳米花进行表征。随后,就不同金属离子、金属盐离子类型以及合成条件对脂肪酶杂化纳米花活性的影响进行了研究。结果表明铜离子可实现最佳固定化效果,且不同含铜无机盐类型对所形成的杂化纳米花活性存在影响。其中,使用硫酸铜合成纳米花可实现100%的包封率,而氯化铜可使最终合成的纳米花相对酶活达到145.7%。酶动力学研究结果表明硫酸铜和氯化铜纳米花的催化效率(kcat/km)分别是游离酶的106%和134%。此外,该固定化方法可有效提高固定化酶的储藏稳定性,室温下储藏30天其酶活仍能保持在80%以上。在重复使用性研究中发现,连续使用固定化酶5次,其仍可维持40%以上的催化活性。（3）疏水材料固定化嗜热脂肪酶的制备及性能研究。本研究分别采用了辛基琼脂糖、苯基琼脂糖、丁基琼脂糖三种疏水性材料来进行脂肪酶固定化。经测量,苯基琼脂糖的载量最高达到4.69 mg·g-1（酶/载体）,与游离酶相比相对酶活达到110%。再进一步通过SEM、EDS、XPS等技术对制备的苯基琼脂糖固定化酶进行表征后,对苯基琼脂糖固定化酶的酶学性质进行了测量。结果表明,其最适反应温度为95℃,较游离酶提高了10℃;最适反应p H为9,p H耐受性基本不变。另外,苯基琼脂糖固定化酶的有机溶剂耐受性要强于游离酶,且苯基琼脂糖固定化酶室温连续储藏30 d其酶活仍能保持60%以上,较游离酶（44%）有显著提高;针对其重复使用性,发现苯基琼脂糖固定化酶在连续使用9次后依然能保持50%的酶活。基于上述结果表明,本研究通过基因工程技术获得了具有较高酶活的嗜热脂肪酶,并成功探索可有效提高其活性和稳定性的固定化方式,为增强其在工业生物催化领域的适用性提供了理论基础。