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人感染高致病性 H7N9 禽流感（Highly pathogenic avian influenza H7N9,HPAIH7N9）病毒病例首次出现于2016年底的H7N9第五波疫情中,之后于2019年春再次出现。作为2013年出现的新型H7N9病毒的变异体,HPAI H7N9病毒的主要特征是其血凝素（Hemagglutinin,HA）蛋白裂解位点上出现多碱性氨基酸的插入,从而使H7N9病毒由低致病性禽流感（Low pathogenic avian influenza,LPAI）病毒转变为高致病性禽流感病毒。虽然人感染HPAI H7N9病例的死亡率与LPAI H7N9（“低致病”指对禽类而言）相似,但似乎前者的病情发展更快、临床症状更严重。截止到2020年4年27日,HPAIH7N9病毒已造成33例实验室确诊病例,其中16例死亡。神经氨酸酶抑制剂（Neuraminidase inhibitors,NAIs）类药物是临床治疗H7N9禽流感病例的主要手段,但由于流感病毒易突变的特点,需对病毒的耐药性进行实时监测。本研究首次系统全面地对人感染HPAI H7N9病毒病例分离株进行NAIs耐药性研究。1、人感染HPAI H7N9禽流感病毒对NAIs的敏感性及突变位点的鉴定:首先对2016～2019年30株HPAI H7N9病例分离株进行神经氨酸酶抑制实验（Neuraminidase inhibition test,NAI test）,结果发现 13%（4/30）的 HPAI H7N9病毒对NAIs敏感性降低,即具有表型耐药特征。同时,通过对病毒进行二代测序并对其神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）基因进行分析,发现23%（7/30）的病毒带有NAIs潜在耐药突变位点,即其NA蛋白上出现R292K、E119V和H274Y氨基酸突变。为研究上述NA氨基酸突变是否是引起HPAI H7N9病毒对NAIs耐药的原因以及是否影响病毒的复制,我们以HPAI H7N9 A/Guangdong/17SF006/2017病毒为骨架,利用反向遗传学技术制备含上述潜在耐药突变位点的HPAIH7N9重组病毒以鉴定突变位点的生物学耐药性及对病毒复制的影响。结果发现,这3个氨基酸单点突变均可使HPAIH7N9病毒对奥司他韦或扎那米韦的敏感性降低或高度降低。含上述耐药突变位点的HPAI H7N9病毒均能在MDCK细胞中有效复制。NA R292K导致病毒复制水平略有下降（P<0.05）,NA E119V和NA H274Y没有明显影响病毒在MDCK细胞上的复制能力（除了 NA274Y在96h条件下,病毒复制滴度下降,P<0.05）。NAE119D突变HPAI H7N9病毒在早期的复制水平与其敏感株相当,NA抑制实验结果显示其对扎那米韦敏感性高度降低。2、HPAI H7N9病毒耐药突变位点及其潜在补偿突变的产生:HPAI H7N9分离株中耐药株所占比例明显高于季节性流感病毒和LPAI H7N9流感病毒。流行病学调查发现,本研究中这7例分离出耐药病毒的HPAI H7N9病例几乎均有明确的NAIs使用史。为研究耐药突变位点产生的原因,我们将对NAIs敏感的HPAI H7N9重组病毒在奥司他韦或扎那米韦存在的情况下进行连续10次传代,之后对每组每一代病毒进行全基因组测序。结果发现奥司他韦用药组病毒NA蛋白上出现R292K、E119V突变,这与经NAIs治疗的HPAI H7N9病例分离株中的耐药突变位点基本一致,说明HPAI H7N9耐药突变与临床治疗时使用NAIs有关,用药过程中筛选出了耐药突变。此外,扎那米韦用药组病毒NA蛋白上出现了E119G突变。在用药情况下,重组病毒内部基因未发生氨基酸突变,而HA蛋白出现了 R238I,G151E,G234T和A146E等多个适应性氨基酸突变,甚至比NA突变出现更早,这些位点均位于HA蛋白晶体结构的HAI区域。考虑到我们上述第1点研究发现HPAI H7N9病毒发生的耐药突变并未显著降低其复制能力,HA突变的出现可能是补偿了 NA突变导致的复制能力下降。3、利用小鼠模型开展协同耐药位点研究:协同耐药位点研究发现NAI222L虽然本身不导致HPAI H7N9病毒耐药,但是其可以增加HPAI H7N9 E1 19V突变病毒的耐药程度。I222L-E119V双位点突变导致重组HPAI H7N9病毒对奥司他韦的IC50是其敏感株的306.34倍,是119V单位点突变病毒的3倍以上。携带NA222L-119V的HPAIH7N9在MDCK细胞中具有良好的复制能力,其峰值大于6log10TCID50/ml。我们用PR8内部基因制备了含上述突变位点的H7N9/PR8减毒重组病毒并用于小鼠实验,结果发现携带NA222L-119V的H7N9/PR8病毒可导致小鼠弥漫性肺炎,体重显著下降及死亡。NA-E119V使H7N9/PR8病毒对奥司他韦耐药,I222L-E119V使得病毒对奥司他韦具有协同耐药效应。总之,人感染HPAI H7N9病毒病例分离株中耐药株所占比例较高,病例在治疗过程中由于使用NAIs引起的NA关键位点氨基酸突变（R292K,E119V,H274Y）导致HPAI H7N9病毒对NAIs敏感性降低,但HPAI H7N9耐药株在哺乳动物细胞中的复制能力和（H7N9/PR8）在小鼠中的致病性未明显降低,且有双位点协同耐药效应存在。因此,应该特别重视HPAI H7N9病毒的耐药监测及新抗病毒药物的研究。