脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种对神经系统具有严重破坏性的疾病,发病人群主要集中在青壮年,不仅给病患本人带来巨大的身体创伤和情感代价,也给社会和家庭带来了严重经济负担,是一个亟待解决的公共卫生难题。面对脊髓损伤,当前临床治疗方法主要是早期手术解除压迫、稳定脊柱结构、脱水抗炎、予以神经营养支持和针对性的康复训练等,但是治疗后病患仍会遗留严重的神经功能障碍。因SCI后神经环路受到破坏、缺血缺氧、炎症反应、脱髓鞘病变、胶质瘢痕形成等诸多不利于神经再生和修复条件限制,使其成为现代脊柱外科领域最为难治的疾患之一。神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是一类具有自我更新和分化能力的多潜能细胞,存在于成年哺乳动物的大脑中侧脑室下区(SVZ区)和海齿状回颗粒下区(SGZ区),在哺乳动物终身的神经发育和修复中起到至关重要的作用。中枢神经系统(central nervous system,CNS)发生损伤后SVZ区的NSCs激活后大量增殖,并且能够迁移到损伤区域分化为功能神经元,整合于受损的神经回路从而促进神经功能恢复。尽管既往研究证实了NSCs对于神经修复和再生的作用,但是NSCs的增殖和定向迁移到损伤灶的能力有限,并且损伤区域不良外界环境限制了其神经修复作用。因此,针对NSCs这一特殊的细胞群体,研究促进其迁移能力的方法及潜在机制具有重大的基础和临床意义。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box protein 1,HMGB1)是HMG家族中存在最为广泛的蛋白成员,HMGB1因参与机体的炎症反应而被熟知,同时研究发现其在细胞的迁移、免疫识别、维持炎症作用等方面都起着关键作用。在CNS疾病中,发现HMGB1可以促进神经母细胞分化为神经元,从而促进神经功能修复,但其对神经干细胞的迁移作用未见相关研究。同时,移植NSCs可以通过自我更新、神经保护、自分泌、再髓鞘化等作用参与脊髓损伤后的神经修复,是一种新的脊髓损伤修复策略,但是移植后的NSCs只有极少数能够分化为功能性的神经元,大部分细胞因诸多外界限制而丧失迁移和分化能力。为了避免这种情况,需要新的方法提高移植后NSCs迁移数量及存活率,保证其神经修复效果。为验证HMGB1对于NSCs迁移和脊髓损伤后修复作用和机制,本研究通过提取和培养NSCs为基础,建立脊髓损伤动物模型,阐明HMGB1对与NSCs迁移及其对脊髓损伤后修复作用和可能机制。具体研究内容如下:一、高迁移率族蛋白B1对神经干细胞迁移中的作用及机制研究目的通过体外培养神经干细胞,建立HMGB1浓度梯度,研究不同浓度HMGB1对NSCs迁移和增殖的影响,采用Western blotting、Transwell、免疫荧光等方法验证HMGB1对NSCs迁移影响及机制。方法第一部分研究提取小鼠脑皮质来源的神经干细胞,所培养的细胞鉴定NSCs标志物Nestin和Sox2的表达,分化培养后鉴定其GFAP、Olig2和DCX的表达;设置分组为:对照组、0.01 ng/ml HMGB1组、0.1 ng/ml HMGB1组、1 ng/ml HMGB1组、10 ng/ml HMGB1组,利用CKK-8法和显微镜下观察测定Neurospheres的直径检测不同浓度HMGB1对于NSCs增殖的影响;Transwell实验观察HMGB1对于NSCs迁移的作用,倒置相差显微镜观察测定HMGB1干预后Neurospheres向外迁移的细胞数目和距离;免疫荧光和Western Blotting分析HMGB1对于NSCs中RAGE表达的影响;通过Phalliodin和tubulin观察HMGB1对于NSCs丝状伪足形成影响和形态变化;使用RAGE拮抗剂FPS-ZM1和RAGE si RNA,探究HMGB1/RAGE对于NSCs迁移的作用机制。结果(1)体外培养的脑皮质来源的细胞,免疫荧光染色结果提示大部分细胞Nestin表达阳性和Sox2阳性,经分化培养后细胞GFAP表达阳性、Olig2表达阳性和DCX表达阳性。提示培养细胞为NSCs,其具有干性特性和分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多向分化潜能;(2)1 ng/ml HMGB1组、10 ng/ml HMGB1组在450 nm吸光度值和Neurospheres直径明显高于其他各组。提示HMGB1能够呈浓度依赖性促进NSCs的增殖;(3)通过Transwell实验及显微镜观察HMGB1干预后NSCs的迁移距离和细胞数目。1 ng/ml HMGB1组神经干细胞球中NSCs迁移数目和距离增加。提示HMGB1能够促进NCSs的迁移;(4)1 ng/ml HMGB1可促进神经干细胞Filopodia形成和升高RAGE表达而促进神经干细胞迁移;(5)HMGB1/RAGE信号通路在1 ng/ml HMGB1介导神经干细胞迁移中具有重要作用。结论1 ng/ml HMGB1可通过促进丝状伪足形成促进神经干细胞迁移;同时,HMGB1/RAGE信号通路在其中具有重要作用。二、高迁移率族蛋白B1对脊髓损伤修复的作用及机制研究目的通过体外培养神经干细胞,建立大鼠脊髓损伤模型,通过移植HMGB1预处理后的NSCs研究其对脊髓损伤后的修复作用,采用Western blotting和免疫荧光方法研究HMGB1对脊髓损伤后修复影响的可能机制。方法本部分研究提取并培养大鼠脑皮质来源的神经干细胞,建立大鼠脊髓损伤模型,移植HMGB1预先处理后的NSCs,使用大鼠BBB评分、机械痛觉测定、冷/热板温觉测定装置评价移植后SCI大鼠运动和感觉功能恢复情况,HE染色和Nissl染色对HMGB1预处理NSCs移植后SCI大鼠损伤区域的神经元和组织结构进行观察,WB和免疫荧光初步研究其促进功能恢复原因和相关机制。结果(1)通过成功构建大鼠SCI模型,使用大鼠BBB评分、机械痛觉测定、冷/热板温觉测定装置进行对照组、NSCs组、HMGB1-NSCs组对SCI模型大鼠的运动和感觉功能恢复评分,在大鼠SCI术后第21天,HMGB1-NSCs组BBB评分、机械痛觉测定评分、冷/热板温觉测定评分都明显优于对照组、NSCs组,提示HMGB1预处理NSCs移植后能够促进SCI模型大鼠运动和感觉功能恢复;(2)取大鼠SCI术后第21天脊髓标本,对脊髓组织切片进行HE染色和Nissl染色,HMGB1-NSCs组相比于对照组、NSCs组损伤面积更小,组织结构更完整和功能性Nissl小体数目更多。提示移植HMGB1预处理后的NSCs能提高SCI模型大鼠的局部神经组织结构重塑水平及残存神经元数目;(3)运用Western blotting和免疫荧光法测定对照组、NSCs组、HMGB1-NSCs组SCI大鼠脊髓损伤区域神经元标记物βIII-tubulin的表达量,HMGB1-NSCs组多于对照组、NSCs组。提示:移植HMGB1预处理神经干细胞可促进脊髓损伤区域的神经元存活;(4)运用Western blotting和免疫荧光法测定NSCs组、HMGB1-NSCs组、HMGB1-NSCs+U0126组βIII-tubulin和ERK表达水平,HMGB1-NSCs组表达增高。提示:HMGB1能够通过ERK信号通路调控NSCs分化。结论移植HMGB1预处理后的NSCs,可促进大鼠脊髓损伤后的神经功能恢复,其作用可能是通过减轻局部损伤和增加局部神经元数量实现,其中增加的神经元数量可能来源于移植的NSCs促进损伤区域神经元的存活及促进移植的NSCs向神经元分化,而其潜在机制可能与激活ERK信号通路相关。