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目的:胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤,在我国其死亡率居恶性肿瘤之首。化疗作为肿瘤术后最有效的辅助治疗手段,在防治肿瘤的复发与转移方面有着举足轻重的作用。虽然目前胃癌的化疗方案不断完善,但部分胃癌患者对化疗的疗效并不理想,其中多药耐药(multidrug resistance, MDR)是导致化疗失败的根本所在。随着现代制药技术的发展,P-糖蛋白抑制剂对肿瘤耐药性逆转受到国内外学者的广泛关注,呈现出良好的前景。粉防己碱(tetrandrine,Tet)是从中草药粉防己的根块中提取的双苄基异喹啉生物碱,具有逆转P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)介导的肿瘤多药耐药(multidrug resistance,MDR)作用。研究表明,粉防己碱具有较强的体内外逆转耐药癌细胞活性,有可能用于临床上耐药胃癌的治疗。奥沙利铂(Oxaliplatin,L-OHP)是继顺铂和卡铂之后的第三代铂类抗肿瘤药,已逐渐作为治疗进展期胃癌的主要药物,且显示出良好的应用前景。目前P-gp蛋白抑制剂粉防己碱逆转胃癌的MDR及其与奥沙利铂联合应用是否增加耐药胃癌细胞对化疗药物的敏感性的相关研究较少。本试验以胃癌细胞株SGC7901及胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR为研究对象,使用粉防己碱、L-OHP进行干预,应用细胞培养技术、细胞形态学、免疫细胞化学、流式细胞术及MTT法,观察、检测粉防己碱、L-OHP对细胞株SGC7901、SGC7901/VCR及MDR相关因子(P-gp、Survivin、GST-π)表达影响及对细胞形态学和抑制率影响。探讨粉防己碱对胃癌细胞MDR逆转机制及其联合L-OHP有效治疗胃癌并减少耐药性提供理论和实验依据。方法:本实验在胃癌细胞株SGC7901及耐药细胞株SGC7901/VCR培养的基础上进行研究,方法如下:1.1应用倒置相差显微镜观察: SGC7901细胞组、SGC7901/VCR组、粉防己碱干预SGC7901/VCR组及粉防己碱联合L-OHP干预SGC7901/VCR细胞组的形态变化。1.2应用MTT法检测在490nm波长处A值,分别计算不同浓度的L-OHP在24h,48h,72h对SGC7901细胞组、SGC7901/VCR组的体外杀伤活性,应用MTT测定粉防己碱体无明显细胞毒剂量(IC10 10%inhibiting concentration,10%抑制率)及此剂量联合L-OHP对SGC7901/VCR细胞48 h的体外杀伤活性。1.3细胞免疫化学形态观察P-gp、Survivin、GST-π在SGC7901组、SGC7901/VCR组、及粉防己碱作用SGC7901/VCR细胞组48小时后染色变化。1.4流式细胞术检测P-gp、Survivin、GST-π表达在SGC7901组、SGC7901/VCR组、及粉防己碱作用SGC7901/VCR细胞组48小时后蛋白表达量的变化。2.统计方法实验数据用SPSS 13.0统计软件处理,P<0.05时认为差异具有显著性。结果:1.粉防己碱、L-OHP对SGC7901及SGC7901/VCR细胞形态学影响1.1 SGC7901及SGC7901/VCR细胞形态特点倒置相差显微镜下观察:SGC7901/VCR细胞与SGC7901细胞相比,SGC7901/VCR形态不规则,细胞较大,胞浆内可见较多颗粒,胞核变大,可见较多漂浮细胞,培养液中泥沙样颗粒较多。1.2粉防己碱(IC10:1μg/ml)对SGC7901/VCR形态学影响倒置显微镜下观察,将SGC7901/VCR细胞加入粉防己碱培养48h后细胞数目稍有减少,排列疏松,细胞形态较未加药变小,出现较多飘浮的细胞,及较多细胞碎片;且胞浆内可见较多颗粒。1.3粉防己碱(IC10:1μg/ml)联合L-OHP对细胞SGC7901/VCR形态学影响倒置显微镜下观察,SGC7901/VCR细胞模糊、消失,细胞形态变圆,体积变小,排列疏松,胞核、胞浆不易分别,可见大量细胞碎片,使贴壁生长的癌细胞出现漂浮。2.粉防己碱、L-OHP对SGC7901及SGC7901/VCR细胞生长的影响2.1 L-OHP对SGC790、SGC7901/VCR细胞生长的影响24h时,L-OHP对SGC7901细胞作用的IC50为11.4μg/ml,对SGC7901/VCR细胞作用的IC50(IC50 :50%inhibiting concentration,半数抑制率)为55.98μg/ml,SGC7901/VCR对L-OHP的耐受性较亲代敏感株SGC7901增加了4.91倍。48h时,L-OHP对SGC7901细胞作用的IC50为6.58μg/ml,对SGC7901/VCR细胞作用的IC50为42.03μg/ml,SGC7901/VCR对L-OHP的耐受性较亲代敏感株SGC7901增加了6.39倍。72h时,L-OHP对SGC7901细胞作用的IC50为3.86μg/ml,对SGC7901/VCR细胞作用的IC50为19.5μg/ml,SGC7901/VCR对L-OHP的耐受性较亲代敏感株SGC7901增加了5.05倍。L-OHP对SGC7901细胞和SGC7901/VCR细胞的体外杀伤活性在72h最强。且杀伤活性随L-OHP浓度的增加而增强,但是SGC7901/VCR对L-OHP的耐药倍数在48小时最大。2.2粉防己碱对SGC7901/VCR细胞48h的体外无明显细胞毒作用剂量(IC10)测定由于SGC7901/VCR对L-OHP的耐药倍数在48小时最大故粉防己碱对SGC7901/VCR细胞体外无明显细胞毒作用剂量选择48小时,(IC10)为1.28μg/ ml,本实验取IC10:1.0μg/ml。2.3粉防己碱联合L-OHP对SGC7901/VCR细胞生长的影响粉防己碱联合L-OHP对SGC7901/VCR细胞体外杀伤活性(IC50:5.82)较单纯使用L-OHP杀伤活性(IC50:42.03)明显增加(P<0.05)。联合杀伤活性的大小随L-OHP浓度的升高而增加。联合粉防己碱治疗后,L-OHP对SGC7901/VCR细胞体外杀伤作用的IC50降低。3.粉防己碱对SGC7901、SGC7901/VCR细胞的P-gp、Survivin、GST-π表达影响3.1 P-gp, Survivin ,GST-π表达的免疫细胞化学染色形态观察P-gp、Survivin在SGC7901/VCR细胞中表达量较高,而在SGC7901细胞均少量表达。SGC7901/VCR细胞经粉防己碱逆转作用48h后,P-gp、Survivin的表达明显减弱(P<0.05)。GST-π在SGC7901/VCR细胞、SGC7901细胞及经粉防己碱逆转作用48h后无明显变化(P>0.05)。3.2 P-gp、Survivin、GST-π蛋白表达量的变化P-gp , Survivin在SGC7901 (P-gp: 304±1.1Survivin: 203±1.5)、SGC7901/VCR(P-gp: 318±1.7 Survivin: 225±2.1)及经粉防己碱逆转作用48h后的SGC7901/VCR(P-gp: 305.3±2.0 Survivin: 207±1.8)细胞中蛋白表达变化明显(P<0.05), GST-π在SGC7901( GST-π: 202±1.9)、SGC7901/VCR( GST-π: 214±1.7)及经粉防己碱逆转作用48h后的SGC7901/VCR( GST-π: 208±1.5)细胞中蛋白表达不明显(P>0.05)。4.无明显细胞毒剂量的粉防己碱(IC10:1μg/ml)对后SGC7901/VCR细胞凋亡的影响SGC7901/VCR细胞的自然凋亡率为4.80%,经1.0μg/ml粉防已碱处理48 h后,细胞凋亡率为6.55%,与自然凋亡率相比无明显变化(P>0.05)。结论:1. SGC7901/VCR细胞与SGC7901细胞均对L-OHP有多药耐药特性,SGC7901/VCR(IC:50: 42.03μg/ml l )比SGC7901 (IC:50: 6.58μg/ml )的耐药性更强。2.粉防已碱在无明显细胞毒剂量(1.0μg/ml)下作用于SGC7901/VCR细胞48小时后SGC7901/VCR细胞的自然凋亡率由4.80%升高到6.55%,与自然凋亡率相比差异不明显。提示1.0μg/ml粉防已碱在此剂量下无明显细胞毒作用,不显著诱导细胞凋亡。3. L-OHP对SGC7901细胞和SGC7901/VCR细胞的体外杀伤活性在72h最强。且杀伤活性随L-OHP浓度的增加而增强,SGC7901/VCR对L-OHP的耐药倍数在48小时最大, SGC7901/VCR对L-OHP的耐受性较亲代敏感株SGC7901增加了6.39倍,说明SGC7901/VCR对L-OHP耐药性强。4.粉防已碱在无明显细胞毒剂量(1.0μg/ml)联合L-OHP可明显降低化疗药物的剂量,有提高化疗效果的作用。其作用机制与粉防已碱逆转胃癌SGC7901/VCR细胞的多药耐药有关。5.粉防已碱在无明显细胞毒剂量(1.0μg/ml)有明显逆转SGC7901/VCR细胞多药耐药的作用,其作用机制与其抑制P-gp,Survivin的表达有关,与GST-π无明显关系。6.粉防己碱有较好的体外逆转MDR作用,且无明显细胞毒作用。与L-OHP联合应用有协同增敏作用。