产蛋与就巢期蛋鸡卵巢转录组分析及发育相关候选基因筛选

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家禽就巢性是一种本能的母性行为,但因为停产而严重降低产蛋率而成为备受养禽研究者的关注,未经选育的我国地方鸡,大多存在就巢性。处于就巢期的鸡卵巢萎缩状态的维持直接影响就巢周期的长度和卵巢恢复并进入产蛋周期的时间。鸡的卵巢发育过程受到多种调节因子的共同影响,以往的研究主要集中在与就巢性相关的候选基因探索,而就巢状态下鸡的卵巢萎缩过程及其分子调控机制还未见报道。本研究对进入典型就巢期30天的绿壳蛋鸡和同龄产蛋期的卵巢进行全转录组测序,对各测序文库中m RNA、mi RNA和lnc RNA进行分别鉴定和深度分析,主要结果如下:1.对绿壳蛋鸡的产蛋规律结果分析表明,第30~54周龄,平均产蛋周期为3.37天,32.34%的鸡产蛋周期为3~4天;相邻两个产蛋周期之间的间隔天数变异范围较大,最短的2天,最长超过5天。第54周龄,46.7%的绿壳蛋鸡在8:00~12:00产蛋,9:00~10:00为产蛋最高峰,占12.17%;绿壳蛋鸡平均产蛋间隔时间为26.54 h,24~26小时的产蛋间隔的比例最大,为32.49%。2.根据鸡激素变化和卵巢发育情况分析,就巢期LH和FSH显著低于产蛋期,PRL显著高于产蛋期。产蛋期的卵巢平均重48.17g,卵巢占体重平均比为1.95%,卵巢平均体积为47.83cm~3,卵巢基质平均重6.9g。就巢期的卵巢平均重2.67g,卵巢占体重平均比为0.16%,卵巢平均体积为4.13cm~3。就巢期的卵巢重、卵巢占体重比、卵巢体积和卵巢基质重均显著低于产蛋期(P<0.05)。与产蛋期卵巢丰满的外观相比,就巢期呈现明显的萎缩现象,卵巢表面只有许多白卵泡,没有等级卵泡(大黄卵泡)和小黄卵泡的富集。卵巢切片在显微镜观察下,产蛋期的卵巢比较松散,初级卵泡和次级卵泡的数量都比较多;就巢期的卵巢比较致密,非常多的初级卵泡,次级卵泡数量很少。3.通过RNA测序文库和mRNA转录本分析,6个测序文库共获得508.93 M(million)读长为125bp的双末端原始读段,平均每个文库的原始读段数量为84.8 M;共产生了63.3 Gb的原始数据;过滤获得502.42 M(98.7%)的高质量读段,平均每个文库83.74 M。共鉴定出49,461个可靠的mRNA转录本,其中15,952个已知转录本,33,509个新转录本。48,992个转录本在产蛋期鸡的正常卵巢(NO)和就巢期鸡的萎缩卵巢(AO)组织中共表达,171个转录本特异性表达于NO组织,298个转录本特异性表达于AO组织。6个测序文库共发现2,198,928个突变位点,包括2,083,946个SNPs,114,982个In Dels;平均每个测序文库发生54,010次可变剪切事件。两种鸡卵巢组织间差异表达的m RNA转录本为3,480个,其中在AO组织显著上调表达的1,761个(50.6%),显著下调表达的1,719个(49.4%)。差异m RNA的功能分析发现,主要富集于内部组织构造发育、脂质和多糖代谢、细胞内信号传递过程、细胞增殖和繁殖等生物学进程。并筛选出与繁殖内分泌系统和卵巢细胞生长发育密切相关基因。4.通过small RNA测序文库分析,6个文库共获得78.32 M的原始读段,平均每个文库的原始读段为13.05 M。过滤得到74.78 M(95.48%)的高质量读段,平均每个文库的高质量读段为12.46 M。共鉴定了2827个mi RNA,其中1777个mi RNA在NO和AO组织中共表达,592个miRNA转录本特异性表达于NO组织,458个miRNA特异性表达于AO组织。2827个miRNA包括634个已知mi RNAs(22.43%)、1423个保守mi RNAs(50.34%)和770个预测的novel mi RNAs(27.24%)。两种鸡卵巢组织间共鉴定出116个差异表达的mi RNA,其中在萎缩卵巢组织显著性高表达的37个(31.9%),在萎缩卵巢中显著性低表达的79个(68.1%)。获得9,081个差异mi RNAs的预测靶基因,包括508个交叉基因。对其功能分析发现,这些交叉基因主要富集于发育过程、细胞粘着、ECM受体互作和器官的形态发生等生物学进程;并筛选出与卵巢发育相关mi RNAs。5.通过RNA测序文库中的lnc RNA转录本分析,在两种卵巢组织中共鉴定了8,714个lncRNA转录本,其中,8,531个lnc RNA转录本在NO和AO组织中共表达,30个lnc RNA转录本特异性表达于NO组织,153个lnc RNA转录本特异性表达于AO组织。这些转录本包括基因间lncRNA转录本7,241个和反义lncRNA转录本846个。与蛋白编码基因比较,这些lncRNA具有表达量很低、转录本长度较短和外显子数目较少等基因组特征。鉴定出两种鸡卵巢组织间差异表达lnc RNA转录本959个,其中在AO组织显著上调表达的903个(94.16%),显著下调表达的56个(5.84%)。Lnc RNA的cis和trans靶基因主要富集到刺激的应答、信号转导的激活、跨膜运输和细胞内物质的基础代谢等生物学通路上。通过ce RNA调控网络分析,筛选出与卵巢发育相关的lnc RNAs。本研究对蛋鸡产蛋期的正常卵巢和就巢期的萎缩卵巢进行了转录组测序,全面建立蛋鸡卵巢组织RNA转录组(m RNA、mi RNA和lnc RNA)表达谱,筛选出鸡卵巢生长发育相关的RNA转录本(尤其是mi RNA和lnc RNA)。该研究结果进一步完善了鸡卵巢生长发育的分子调控网络,也为鸡卵巢萎缩过程相关非编码RNA的研究提供有效参考。
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