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蜂王浆(RJ)糖蛋白特别是蜂王浆主蛋白家族(MRJPs)含量超过RJ蛋白总量的85％，它们是RJ中最具特异性生理功能的蛋白。糖蛋白中的糖链可以改变蛋白的构型并调节其生物学功能，影响蛋白和蛋白间的相互作用。鉴于目前对RJ中糖蛋白特别是糖链、糖肽及其糖基化位点研究的不足，本研究旨在对RJ中的糖蛋白进行详尽的结构表征。蜂王浆主蛋白1(MRJP1)被认为是RJ中主要的致敏糖蛋白，它会使易感人群反生严重的过敏反应，因此有必要建立一种高特异性、高灵敏度的过敏原定量方法检测MRJP1的含量。另外，有文献报道RJ能引起速发型超敏反应，但是目前还没有相关文献报道MRJP1的致敏性反应及其致敏机理。因此本研究的另一个目标旨在建立MRJP1致敏小鼠模型，探索其致敏机理并且筛选能够缓解其过敏反应的相关活性物质。糖胺聚糖(GAG)作为一类具有多种生物活性的大分子，包括硫酸软骨素(CS)和皮肤素(DS)已被证实在体内和体外的免疫应答中起到重要作用，并能够增强免疫活性，发挥免疫调节作用。因此本研究拟以GAG作为潜在的具有降敏作用的物质，研究其对MRJP1致敏小鼠的免疫调节作用，针对其降敏作用进行详细地探讨，并初步探索其降敏机理，为进一步研究食物过敏及其治疗机理、开发抗过敏药物提供理论依据。本文的主要研究内容及结果如下:
首先，结合蛋白组学及SDS-PAGE电泳技术对RJ中含量最丰富的两个糖蛋白MRJP1和MRJP2进行了结构鉴定，所鉴定肽段覆盖率分别达到88.89％和80.53％,鉴定的肽段个数分别为298个和126个。建立了一种基于蛋白质胰蛋白酶酶解产物中特征肽段和稳定同位素标记的内标肽并结合UPLC-MRM-MS/MS定量分析方法，来定量RJ中的致敏糖蛋白MRJP1，并进行了方法学验证，最后此方法成功应用于多种市售RJ样品中致敏糖蛋白的准确定量;该蛋白定量方法具有选择性和特异性强、准确度高、重复性好、线性范围宽(5～1000ng/mL)、回收率高(85.33％～95.80％)、检测限低(LOD7.77μg/g RJ)等优点，既可以用于RJ样品中MRJP1的准确定量，也可以延伸到其他类型糖蛋白的定量应用中;另外，该方法还可用于致敏蛋白的定量分析，为过敏原蛋白的限量检测标准提供理论参考。
其次，从糖链水平出发，对RJ中糖蛋白的糖链进行结构表征。使用离子肼质谱仪、采用针泵直接进样方式、MSn扫描模式、CID断裂方式对RJ蛋白中经PNGase F酶解释放且完全甲基化的N-糖链进行详细地结构分析，最后鉴定得到13种N-糖链，其中包括7种高甘露糖型(Man3～9GlcNAc2)、5种复杂型（Hex3HexNAc3、Hex4HexNAc3、Hex3HexNAc4、Hex3HexNAc5和Hex4HexNAc5）和一种杂交型(Hex5HexNAc3)糖链;这些N-糖链在分支方面包含了单触角、二触角和三触角三种种类型。该多级质谱CID碎裂方式可以实现对糖链结构的详细解析，包括其糖链组成、分子量、结构分支和单糖连接情况。接着，从糖肽水平出发，对RJ糖蛋白的糖基化修饰进行了详细地解析。使用HILIC-ion trap-MSn对RJ糖蛋白的胰蛋白酶酶解产物进行分离和鉴定，通过自动采集MS2和手动采集MS3质谱模式对糖肽进行结构表征。通过上述建立的糖肽鉴定方法，本研究总共鉴定了48个N-糖肽，6个糖基化位点，26种N-糖链。这些糖肽主要分布在MRJP1和MRJP2中，另外还有一个糖肽属于蜜蜂糖蛋白40S ribosomal protein S8(O76756)。MRJP1中鉴定到两个糖基化位点，即N177和N394;MRJP2中鉴定到三个糖基化位点，即N145、N178和N92。所鉴定的26种糖链中全部是N-糖链，糖链的类型包括高甘露糖型、复杂型和杂交型三种。本研究发现了蜂王浆蛋白中3个新的糖基化位点，分别是位点N92，对应的肽段序列YDGVPSTLNVISGKTGK（MRJP2，糖链组成Man8GlcNAc2）;位点N394，对应的肽段序列M(Qxidation)VNNDFN FDDVNFR（MRJP1，糖链组成Man9GlcNAc2）;位点N84，对应的肽段序列IIDVVYNASNNELVR(O76756，糖链组成Man9GlcNAc2)。这三个新的糖基化位点是UniProt数据库中没有预测过的，且未见其他相关文献报道。
其后，使用MRJP1免疫兔子获得了MRJP1多克隆抗体，并利用ELISA方法对本研究中提取的GAGs和MRJP1多克隆抗体之间的亲和性进行了考察，结果发现和MRJP1多克隆抗体亲和效果比较好的GAGs分别为鮟鱇鱼DS、鮟鱇鱼CS和三文鱼CS。随后对亲和性不同的GAGs做了详细的结构表征，并对这类多糖分子的结构与其结合能力之间的关系进行了阐述分析，发现GAG分子与蛋白之间的亲和能力和其硫酸化程度、多糖类型、二糖种类及其比例、硫酸化位点等有很大的关系。
最后，建立了Balb/c小鼠MRJP1致敏模型和糖胺聚糖给糖降敏模型，对模型组和给药治疗组小鼠的过敏反应及其缓解情况进行了研究。结果发现GAG组的小鼠过敏症状相比较于致敏模型组得到明显的缓解;鮟鱇鱼CS低、中剂量组和鮟鱇鱼DS组均可以显著性降低致敏小鼠血清中总IgE、特异性IgE、组胺及小鼠脾细胞中Th2细胞因子IL-4的含量，从而起到缓解MRJP1致敏小鼠过敏反应的作用，其降敏机理可能与抑制抗原特异性Th2细胞的分化、抑制B细胞中抗原特异性IgE抗体的产生有关。
首先，结合蛋白组学及SDS-PAGE电泳技术对RJ中含量最丰富的两个糖蛋白MRJP1和MRJP2进行了结构鉴定，所鉴定肽段覆盖率分别达到88.89％和80.53％,鉴定的肽段个数分别为298个和126个。建立了一种基于蛋白质胰蛋白酶酶解产物中特征肽段和稳定同位素标记的内标肽并结合UPLC-MRM-MS/MS定量分析方法，来定量RJ中的致敏糖蛋白MRJP1，并进行了方法学验证，最后此方法成功应用于多种市售RJ样品中致敏糖蛋白的准确定量;该蛋白定量方法具有选择性和特异性强、准确度高、重复性好、线性范围宽(5～1000ng/mL)、回收率高(85.33％～95.80％)、检测限低(LOD7.77μg/g RJ)等优点，既可以用于RJ样品中MRJP1的准确定量，也可以延伸到其他类型糖蛋白的定量应用中;另外，该方法还可用于致敏蛋白的定量分析，为过敏原蛋白的限量检测标准提供理论参考。
其次，从糖链水平出发，对RJ中糖蛋白的糖链进行结构表征。使用离子肼质谱仪、采用针泵直接进样方式、MSn扫描模式、CID断裂方式对RJ蛋白中经PNGase F酶解释放且完全甲基化的N-糖链进行详细地结构分析，最后鉴定得到13种N-糖链，其中包括7种高甘露糖型(Man3～9GlcNAc2)、5种复杂型（Hex3HexNAc3、Hex4HexNAc3、Hex3HexNAc4、Hex3HexNAc5和Hex4HexNAc5）和一种杂交型(Hex5HexNAc3)糖链;这些N-糖链在分支方面包含了单触角、二触角和三触角三种种类型。该多级质谱CID碎裂方式可以实现对糖链结构的详细解析，包括其糖链组成、分子量、结构分支和单糖连接情况。接着，从糖肽水平出发，对RJ糖蛋白的糖基化修饰进行了详细地解析。使用HILIC-ion trap-MSn对RJ糖蛋白的胰蛋白酶酶解产物进行分离和鉴定，通过自动采集MS2和手动采集MS3质谱模式对糖肽进行结构表征。通过上述建立的糖肽鉴定方法，本研究总共鉴定了48个N-糖肽，6个糖基化位点，26种N-糖链。这些糖肽主要分布在MRJP1和MRJP2中，另外还有一个糖肽属于蜜蜂糖蛋白40S ribosomal protein S8(O76756)。MRJP1中鉴定到两个糖基化位点，即N177和N394;MRJP2中鉴定到三个糖基化位点，即N145、N178和N92。所鉴定的26种糖链中全部是N-糖链，糖链的类型包括高甘露糖型、复杂型和杂交型三种。本研究发现了蜂王浆蛋白中3个新的糖基化位点，分别是位点N92，对应的肽段序列YDGVPSTLNVISGKTGK（MRJP2，糖链组成Man8GlcNAc2）;位点N394，对应的肽段序列M(Qxidation)VNNDFN FDDVNFR（MRJP1，糖链组成Man9GlcNAc2）;位点N84，对应的肽段序列IIDVVYNASNNELVR(O76756，糖链组成Man9GlcNAc2)。这三个新的糖基化位点是UniProt数据库中没有预测过的，且未见其他相关文献报道。
其后，使用MRJP1免疫兔子获得了MRJP1多克隆抗体，并利用ELISA方法对本研究中提取的GAGs和MRJP1多克隆抗体之间的亲和性进行了考察，结果发现和MRJP1多克隆抗体亲和效果比较好的GAGs分别为鮟鱇鱼DS、鮟鱇鱼CS和三文鱼CS。随后对亲和性不同的GAGs做了详细的结构表征，并对这类多糖分子的结构与其结合能力之间的关系进行了阐述分析，发现GAG分子与蛋白之间的亲和能力和其硫酸化程度、多糖类型、二糖种类及其比例、硫酸化位点等有很大的关系。
最后，建立了Balb/c小鼠MRJP1致敏模型和糖胺聚糖给糖降敏模型，对模型组和给药治疗组小鼠的过敏反应及其缓解情况进行了研究。结果发现GAG组的小鼠过敏症状相比较于致敏模型组得到明显的缓解;鮟鱇鱼CS低、中剂量组和鮟鱇鱼DS组均可以显著性降低致敏小鼠血清中总IgE、特异性IgE、组胺及小鼠脾细胞中Th2细胞因子IL-4的含量，从而起到缓解MRJP1致敏小鼠过敏反应的作用，其降敏机理可能与抑制抗原特异性Th2细胞的分化、抑制B细胞中抗原特异性IgE抗体的产生有关。