论文部分内容阅读
目的:本课题主要研究m PGES1下游通路前列腺素E2(PGE2)及其受体(E-prostanoid receptors)EP1-EP4与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生发展之间的关系,明确PGE2在肝癌发生发展过程中可能激活某种EP受体亚型从而促进肝癌发生发展,为阻断m PGES1下游通路PGE2-EP2而治疗肝癌提供实验依据。方法:1.采用酶联免疫吸附剂测定(ELISA)的实验方法检测30例肝癌及其相应的癌旁组织与6例正常肝组织中PGE2的含量,并统计分析在肝癌组织中PGE2含量与临床病理参数的关系。2.应用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)的方法在m RNA水平上检测34例肝癌组织中EP1-EP4受体表达情况,并统计EP受体表达量与肝癌临床病理参数之间的相关性,分析4种EP受体与肝癌临床病理参数的关系。3.采用免疫组化的方法检测组织芯片中145例肝癌患者肝癌及癌旁组织中EP1-EP4四种受体的表达情况,观察EP受体在肝癌组织中的定位。4.应用蛋白免疫印迹(Western Blot)的方法在蛋白水平上比较34例肝癌组织及其相应的癌旁组织中EP1-EP4受体的表达情况的不同。5.培养肝癌细胞(Hep G2,Hep3B,Huh7,MHCC-97h,SMMC-7721等),检测肝癌细胞中PGE2的含量及其4种EP受体表达情况。6.采用MTT、Transwell、细胞划痕实验等方法,检测添加外源性PGE2和添加EP2受体抑制剂作用后,肝癌细胞株增殖、侵袭迁移能力的改变情况。7.应用Western Blot和RT-PCR的方法分组检测应用EP2受体抑制剂及添加外源性PGE2后,肝癌细胞中EP2受体的表达的不同,探讨在肝癌细胞中PGE2通过调控EP2受体发挥何种作用。结果:(1)ELISA实验检测30例HCC患者肝癌组织及相应的癌旁组织和6例正常肝组织,结果表明在肝癌组织中PGE2含量(605.78±16.41)pg高于癌旁组织(456.75.±13.37)pg和正常肝组织(124.35±5.79)pg,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)结合ELISA结果,经卡方检验统计分析结果显示,PGE2含量与HCC患者的生存时间、肝细胞癌是否发生转移、肿瘤的分化程度、有无硬化背景有关,P<0.05,而与其他临床病理参数之间的相关性无统计学意义。(3)RT-PCR结果显示,在34例HCC患者肝癌组织中,与相应癌旁肝组织的表达量相比,4个EP受体在m RNA水平的相对表达量(Relative quantity,RQ)分别为:(0.54±2.44);(0.77±1.13);(2.21±3.74);(1.37±2.70),4个受体在癌组织与相应癌旁组织中的差异均无统计学意义(P>0.05)。(4)免疫组化结果显示,在肝癌及癌旁组织中,EP1-EP4四种受体的表达主要定位于细胞质中。(5)Western Blot结果显示:在34例HCC患者中,EP2蛋白的相对表达量(1.586±0.108)高于相应癌旁组织(0.765±0.089),差异具有统计学意义(P<0.001)。(6)Western Blot结果显示:4个EP受体在蛋白水平的表达EP2最高(相对表达量1.586±0.108),差异具有统计学意义(P<0.05)。(7)对RT-PCR、Western Blot及ELISA结果与临床病理参数进行统计学分析,结果显示在肝癌组织中PGE2含量与EP2受体表达量呈正相关,EP2受体在m RNA和蛋白水平上的表达与患者的年龄,肿瘤分化程度,术后是否复发以及肿瘤的转移有关,差异具有统计学意义(P<0.05),而与其他临床病理参数无关。(8)Western Blot结果显示,6种肝癌细胞中4种EP受体均有表达,在Hep G2细胞EP2受体蛋白高表达。(9)Western Blot结果显示,添加外源性PGE2作用后,EP2受体表达与未添加外源性PGE2组相比明显增加(P<0.05)。(10)ELISA结果显示,Hep G2细胞培养中添加EP2受体抑制剂后,PGE2含量增加,且MTT实验结果显示,Hep G2增殖减慢,提示PGE2可能通过EP2受体促进肝癌细胞增殖。(11)细胞Transwell实验结果显示EP2受体抑制剂浓度越高(0μM,1μM,2μM,5μM),Hep G2细胞侵袭的细胞数目越多(121.67±3.06,108.33±8.50,92.67±3.05,69.67±3.05)个,迁移的细胞数目也越多(141.67±3.79,135.67±4.51,96.33±4.51,86.33±7.37)个,其侵袭迁移能力越强(P<0.05);同时外源性PGE2组、EP2受体抑制剂组与对照组相比,外源性PGE2组Hep G2细胞侵袭迁移的细胞数增加,而EP2抑制剂组Hep G2细胞侵袭迁移的细胞数明显减少(P<0.05)结论:1.m PGES1下游PGE2-EP2信号通路与肝癌发生发展密切相关。2.HCC患者中PGE2含量在肝癌组织中明显高于相应的癌旁组织及正常肝组织,肝癌组织中PGE2含量与HCC患者的生存时间,是否发生转移,肿瘤的分化程度,有无硬化背景有关。3.EP2受体与HCC患者的年龄、肿瘤分化程度、术后是否复发、是否发生转移以及肿瘤的数目有关。4.PGE2可能通过EP2受体促进肝癌细胞的增殖和侵袭。