家蚕(Bombyx mori)作为生产用经济昆虫,雄性在体质、丝蛋白质合成效率和蚕丝品质等方面都优于雌性,其调控机理目前还了解很少。限性遗传是家蚕的一种应用广泛的遗传方式,其中茧色限性遗传方式,与斑纹限性一样广泛用于蚕种生产过程的雌雄分离制种。家蚕天然有色茧是具有重大应用前景的遗传资源,有色茧的茧丝颜色种类、色度、色牢度、色匀度等茧色相关遗传控制,不仅仅受数十个(推测)色素结合与转运主基因控制,还受到更加复杂的基因网络影响,分子遗传研究表明相关基因未完全确认。家蚕黄茧限性品种(雌为黄茧,雄为白茧),为研究黄、白茧之间差异表达基因提供了非常好的材料。
　　本文使用该系统Ysh蚕品种,构建了不同性别的LongSAGE表达谱文库,筛选了差异表达基因。通过构建的apEST电子表达谱、在线芯片表达谱平台(BmMDB)的查询以及RT-PCR、Real-Time PCR、免疫组化和Western blotting等实验技术,调查了雌雄差异表达基因在Ysh及其它几个品种中的时空表达谱、激素处理和限食处理后的基因调控变化,测定了相关品种组织中的总蛋白酶和胰蛋白酶活性,并对丝氨酸蛋白酶前体(SPP)和丝氨酸蛋白酶抑制剂1(SPI1)进行了蛋白水平上的调查,获得的主要结果如下。1 apEST提供了电子表达谱的查询与分析平台构建了基于家蚕dbEST为数据源(截止2011年3月20有316,223条EST)的基因电子表达谱分析平台(apEST)(http://jysw.suda.edu.cn/bombyx/Download.html)。通过和其它基因表达谱分析平台的比较,明确了其可靠性和可行性。该平台能为挖掘特异性基因提供有利参考,在本实验室已进行了广泛的应用。2构建了黄茧限性系统雌雄的Long SAGE文库根据家蚕幼虫色素快速积累时期和组织特异性,构建了以整个5龄幼虫期中肠和丝腺为材料的的Ysh蚕品种雌雄Long SAGE文库,总共获得了32,099个标签,筛选出202个差异标签(Tag),其中108个Tag在雌性中上调表达,94个Tag在雄性中上调表达。借助家蚕全基因组公共数据库,通过参考文库和改进的GLGI方法,对其中76个Tag进行了注释,为茧色相关基因发掘,特别是色素结合与转运主基因以外的新基因发掘创造了平台。SAGE文库提供的大量性别差异标签,得到其全长并进行功能研究对于阐明限性黄茧品种雌雄差异性状机理是有价值的。3丝氨酸蛋白酶(SPs)和丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpins)是互作关系的酶类在家蚕Ysh品种5龄前中期,幼虫中肠特异表达的SPs基因的mRNA表达量,以及胰蛋白酶活性都高于5龄末期,也高于眠期,同时眠期检测不到SPP蛋白的表达。Spp基因受饥饿处理的瞬时调控,推测食物进入中肠后诱导了参与中肠食物蛋白质消化与吸收的SPs分泌,后者又启动了SPs基因的表达,而停止喂食,蛋白酶分泌也停止。SPs的表达特征提供了SPs参与中肠食物蛋白的分子证据。SPs基因在5龄后期雌蚕的中肠表达量高于雄性,推测与雌性造卵需要更多的蛋白质营养有关。5龄中后期出现的丝腺特异表达的Serpins基因表达活性,在分子水平上印证了家蚕吐丝前需要Serpins保护丝腺中大量积累的丝物质不被蛋白酶降解的生理现象,不同时期和组织间(MSG和PSG)所需Serpins种类差异,体现了家蚕复杂的丝物质合成与储藏调控网络。而Spi1基因在雄性丝腺中表达和蛋白质翻译的持续时间比雌性中长,推测与雄性丝物质质量和数量比雌性有优势有关。外源性的蜕皮激素(MH)处理5龄3日家蚕幼虫,SPs和Serpins基因呈现不同的调控机制,保幼激素类似物(JHA)对这2个基因的表达具有类似的正调控作用。激素对基因的调控主要与发育时期及激素剂量有关。Spi1基因在幼虫饥饿处理后出现下调比Spp晚,暗示Serpins受取食的直接影响比SPs慢,也说明了食物供需对丝腺的反应迟于对中肠的影响。SPs和Serpins基因的这种组织表达特异性,为它们参与相应组织中的特异性转录调控提供了佐证,而发育时期表达差异和激素处理后调控变化体现了基因执行功能上的时序性和特殊性。Serpins中的许多成员通过抑制SPs的同功酶来参与SPs的活性调控,保持体内环境的平衡。4推测表皮蛋白基因CPH45克隆与功能研究根据SAGE文库中标签GCTTCCGCCGTGCCTGC(Tag.1161),克隆到了一个长度为676 bp的全长cDNA序列,序列分析只有1个外显子,没有内含子,推导的编码蛋白序列长度为165AA,位于家蚕第19号染色体的nscaf2767上。该基因在中肠特异表达,与家蚕CPH家族的4条蛋白序列同源性在42％以上,根据已有的家蚕CPH基因名称顺序,新基因命名为中肠特异表达的CPH基因(CPH45)。CPH45表达量在Ysh品种雄性显著高于雌性,受到5龄中期外源性MH的负调控和JHA的正调控,雄性对外源昆虫激素的感受更敏感。食物的供缺对CPH45基因的表达水平没有显著影响,推测其不直接参与食物的消化。功能研究表明CPH45在维持家蚕中肠形态中发挥作用。CPH45基因在蚕品种之间的表达差异显示,它在不同的品种中参与路径的位点不同,作用可能存在差异。5保幼激素甲基转移酶基因JHAMT2克隆与分析根据SAGE文库中标签序列GAAACAGCACGCACGCT(Tag.1221),克隆到了一个长度为1007 bp的全长cDNA序列,序列分析有4个外显子,定位于家蚕第12号染色体的nscaf2993上。推导的编码蛋白序列长度为266AA,有一个甲基转移酶超家族功能位点,与烟草天蛾(Manduca sexta)JHAMT同源性达到38％,因此克隆基因命名为家蚕保幼激素甲基转移酶基因(JHAMT2)。JHAMT2基因在丝腺、特别是中部丝腺组织特异表达,发育时期表现为4龄期有比较高的表达量,5龄期只在5龄第3日有表达,性别差异表现为雄性体内持续表达时间比雌性中长。JHAMT2基因时期表达特征在分子水平上印证了家蚕JH的合成在4龄期比较旺盛,在5龄第3日后受到抑制,对位于其合成上游的JHAMT需要量也相应的降低。