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漆酶(laccase，EC．1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，具有降解木质素和有毒酚类物质的作用，在造纸工业、食品饮料和生物修复等领域具有广泛的应用前景。但大多数真菌在天然条件下生长缓慢，且产漆酶活性较低，大大限制了漆酶在工业领域中的应用。本研究主要对四种真菌(白腐菌TR16、木霉LaTr01、灵芝TR6、香菇Le1)的漆酶基因进行克隆及序列分析，并对灵芝TR6漆酶基因在毕赤酵母中的表达进行初步的研究。主要研究结果如下：
(1)白腐菌TR16漆酶基因全长cDNA序列和完整DNA序列扩增。利用锚定PCR技术和3RACE技术从白腐菌TR16中扩增得到漆酶全长cDNA序列，共1810bp，包括完整的开放读码框(1554bp)，编码517个氨基酸；该氨基酸序列具有3个保守的铜离子结合区域，7个潜在的糖基化位点和1个蛋白激酶磷酸化位点，其相对分子量为56.3kDa，等电点为5.89；经PCR扩增得到了该酶全长的DNA序列长4505bp，该序列除包含全部白腐菌TR16菌株漆酶cDNA编码区外，还包括12个内含子序列，长度在52—91bp之间，是典型的真核生物内含子，包括5’端的供体剪切位点和3’端的受体剪切位点。
(2)木霉LaTr01漆酶基因全长cDNA序列和完整DNA序列扩增。利用锚定PCR技术和反向长距离PCR技术从木霉LaTr01中扩增得到漆酶全长cDNA序列，共1885bp，包括完整的开放读码框(1773bp)，编码590个氨基酸；该氨基酸序列中具有3个保守的铜离子结合区域，6个潜在的N—糖基化位点，8个潜在的蛋白激酶磷酸化位点，其相对分子量为65.0kDa，等电点为6.34。经PCR扩增得到了漆酶全长DNA序列长3084bp，该序列除包含全部木霉LATR01菌株漆酶cDNA编码区外，还包括2个内含子序列，长度分别为72bp和74bp。
(3)灵芝TR6漆酶基因全长cDNA序列和完整DNA序列扩增。利用RT-PCR技术扩增得到漆酶全长cDNA序列，共1663bp，包括完整的开放读码框(1563bp)，编码520个氨基酸；该氨基酸序列中具有3个的铜离子结合区域，10个潜在的糖基化位点和1个蛋白激酶磷酸化位点，其相对分子量为56.2kDa，等电点为5.58；经PCR扩增得到的漆酶全长DNA序列长2573bp，该序列除包含全部灵芝TR6菌株漆酶cDNA编码区外，还包括9个内含子序列，长度在51—67bp之间，是典型的真核生物内含子，包括5’端的供体剪切位点和3’端的受体剪切位点。
(4)香菇Le1漆酶基因全长cDNA序列和完整DNA序列扩增。利用RT-PCR技术扩增得到了漆酶全长cDNA序列，共1650bp，包括完整的开放读码框(1602bp)，编码533个氨基酸；该氨基酸序列中具有3个的铜离子结合区域，10个潜在的糖基化位点和1个蛋白激酶磷酸化位点，其相对分子量为57.8kDa，等电点为5.00。经PCR扩增得到的漆酶全长DNA序列，共2823bp，该序列除包含全部香菇Le1漆酶cDNA编码区外，还包括10个内含子序列，长度在47—62bp之间，是典型的真核生物内含子，包括5’端的供体剪切位点和3’端的受体剪切位点。
(5)灵芝TR6漆酶基因在毕赤酵母中异源表达研究。灵芝TR6漆酶基因与表达载体pPIC9K连接构建重组质粒pPIC9K/lac-TR6后通过电击转化PichiapastorisGS115，重组菌利用经MD平板初筛，愈创木酚平板复选，采用菌落PCR进一步验证重组质粒已经插入到酵母基因组中。阳性转化子在BMMY诱导培养基中实现了目的漆酶基因的分泌表达，重组漆酶的活性较低，最高漆酶活性达到160U/L。重组漆酶的表达活性较低可能与信号肽的选用，酵母密码子的偏好性和培养条件等因素有关。