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神经生长因子受体p75(p75NTR)属于I型细胞跨膜糖蛋白,由399个氨基酸组成。p75NTR存在于多种细胞的表面,包括中枢和外周神经系统的神经元、肥大细胞、T/B淋巴细胞、中性粒细胞等免疫细胞。此外p75NTR也广泛地存在于非神经组织如上皮、间叶及淋巴造血组织。我们的研究发现p75NTR在胃癌细胞中的表达显著低于癌旁组织,提示p75NTR在胃癌的发生发展中可能发挥重要作用。p75NTR的结构相对于另一组拥有酪氨酸激酶活性的神经营养因子受体比较简单,并且具有更相似于标准的死亡受体的结构。p75NTR已有的功能研究大多集中在中枢神经系统,目前很多实验结果还有争议。例如在神经系统发展过程中,神经营养因子是促进神经元生存、分化和髓鞘形成的必要因子。然而p75受体也确保了新生神经元快速并恰当的凋亡。直到现在,p75NTR受体掌控这些相对立的功能的机制仍然不清楚。既往的研究表明,p75NTR是一个潜在的肿瘤抑制剂,它可以抑制前列腺癌的生长和增殖;然而也有报道认为它可以作为生存受体促进黑色素瘤细胞的脑转移,这一矛盾提示我们p75NTR在不同的环境和肿瘤中发挥了不同的作用。在我们前期的研究中发现:p75NTR在胃癌中的表达降低或缺失;p75NTR可以通过细胞周期阻滞抑制胃癌生长。然而,p75NTR是否与胃癌的转移有关尚不清楚,本课题将对此进行探讨。【目的】1、研究p75NTR在无转移胃癌和有转移胃癌中的表达情况;2、研究p75NTR与胃癌侵袭和转移的相关性;3、探讨p75NTR抑制胃癌细胞侵袭和转移的可能机制。【方法】1、利用免疫组化观察p75NTR在有转移和无转移胃癌组织中的表达;2、Western Blot方法检测多种胃癌细胞系中p75NTR蛋白表达;3、通过基因重组方法构建p75NTR的siRNA载体;4、利用体外细胞粘附实验、Transwell侵袭实验和移动实验,裸鼠尾静脉注射体内肝脏转移实验等研究p75NTR对胃癌细胞SGC7901和MKN45的体外粘附和侵袭以及体内转移能力的影响;5、通过Western Blot检测不同细胞系中p75NTR表达的变化与NFκB信号通路中的相关分子和uPA、MMP9、TIMP1等的表达水平变化的关系。【结果】1、p75NTR在有转移的胃癌中表达降低。我们利用免疫组化技术检测了p75NTR在106例无转移胃癌和106例有转移胃癌中的表达,发现p75NTR主要定位于胃癌细胞的胞浆和胞膜上,但p75NTR在有转移胃癌原发灶和转移灶中的表达没有明显差异。p75NTR在有转移胃癌的表达率为15.09%(16/106),低于无转移胃癌的64.15% (68/106)(p < 0.01),在有转移胃癌的染色评分显著低于无转移胃癌(0.23±0.18比1.21±0.35,p < 0.01)。研究还发现p75NTR在肝脏高转移胃癌细胞系XGC9811-L的表达低于其他胃癌细胞系。这些结果提示p75NTR倾向于在转移性胃癌中低表达。2、p75NTR抑制胃癌细胞的体外粘附、侵袭、移动及裸鼠体内肝脏转移能力。我们进而构建了p75NTR的两个siRNA载体,稳定转染了胃癌SGC7901和MKN45细胞,发现其中p75NTRsi1载体能显著抑制胃癌细胞系SGC7901和MKN45中p75NTR的表达;p75NTR可以导致SGC7901和MKN45对细胞外基质模仿物Matrigel的粘附能力降低,在4h的时候粘附细胞数的差异最为明显。粘附4h时p75NTR稳定转染对SGC7901和MKN45细胞的粘附能力分别被抑制了48.3%和45.5%;p75NTR可以抑制SGC7901和MKN45细胞穿过Transwell小室的侵袭和移动能力。p75NTR转染使SGC7901和MKN45的侵袭细胞数分别减少了48.6%和52.7%,使SGC7901和MKN45的迁移细胞数分别减少了49.6%和57.7%;裸鼠体内肝脏转移实验表明,p75NTR可以显著抑制SGC7901和MKN45细胞的肝脏转移能力,p75NTR对SGC7901和MKN45细胞的肝脏转移的抑制率分别为62.7%和52.8%。上述结果提示,胃癌细胞中的p75NTR有抑制胃癌细胞对细胞外基质的粘附、侵袭和体内转移的作用。3、p75NTR抑制胃癌转移的作用与抑制NFκB信号转导通路下调uPA、MMP9而上调TIMP1的表达有关。我们进一步用Western blot方法证实p75NTR能下调uPA的蛋白表达以及MMP9的蛋白和细胞上清中的活性形式的表达,并能上调TIMP1的蛋白表达。p75NTR对MMP2和TIMP2的表达没有显著影响。进一步研究发现,p75NTR可以下调IKKα、IKKβ和NFκB (p65/RelA亚单位)的蛋白水平以及IκBα的磷酸化水平而上调IκBα的蛋白水平。NFκB的特异阻断剂SN50能显著降低uPA和MMP9的蛋白表达而增加TIMP1的蛋白表达。NFκB的特异阻断剂SN50以及uPA和MMP9的抗体对p75NTR高或低表达的SGC7901和MKN45细胞的侵袭能力都有明显的抑制,此作用在p75NTR高表达细胞系中的效应更明显。这些结果提示NFκB信号通路的抑制以及随后uPA、MMP9表达下调和TIMP1表达上调与p75NTR的作用有关。【结论】p75NTR的表达与胃癌的转移状态呈负相关;p75NTR有抑制胃癌细胞侵袭和转移的能力;p75NTR至少部分通过抑制NFκB信号通路随后下调uPA、MMP9的表达并上调TIMP1表达来发挥抑制胃癌转移的作用。