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本论文旨在研究硒(Se)通过Nrf2/GPX1-PPARγ-NF-κB信号通路对二乙烯三胺/一氧化氮聚合物(NO/DETA)诱导损伤的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)的减缓作用,以期为生产过程中科学补Se,提高奶牛乳腺组织的抗氧化功能提供理论依据。论文分为3个试验进行研究。试验一采用单因子完全随机试验设计,将第三代BMECs分为8个处理组,每个处理6个重复,第一组为对照(CON)组,不添加Se和NO/DETA,培养30h;第2～8组分别为NO/DETA损伤组和6个Se保护组,是在CON组培养基中添加不同剂量的Se(0、10、20、50、100、150、200 nmol/L),培养24h后,添加1000 μmol/L的NO/DETA作为应激源,与Se共同作用6h,探讨不同剂量的Se对NO损伤后的BMECs的预保护作用,结合硒蛋白酶、炎症因子的基因表达和酶活性以及过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARy)、转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)和核转录因子-κB(NF-kB)信号通路的相关基因表达量探讨其可能存在的机理,并筛选适宜的Se保护剂量。试验二分为两个部分,均采用单因子随机试验设计,第一部分为添加不同剂量的PPARy抑制剂(GW9662),培养6h,通过测定细胞增殖率确定GW9662在细胞中的适宜添加剂量;第二部分利用GW9662(浓度依据第一部分确定)阻断PPARy,将BMECs分为七个组,第1组为CON组;第2～7组分别为NO/DETA损伤组、GW9662抑制剂组、单独加Se组(根据试验一确定Se浓度)、Se+DETA(Se 预保护)组、Se+GW9662 组、Se+DETA+GW9662 组。研究Se是否从PPARγ-NF-κB信号通路来缓解NO造成的细胞氧化损伤。试验三利用沉默GPX1技术,将试验分为7个处理组,分别是CON组、NO/DETA损伤组、Se处理组、Se+DETA(Se 预保护)组、Se+GPX1shRNA 组、Se+DETA+GPX1shRNA 组。探讨Se从Nrf2/GPX1-PPARγ-NF-kB信号通路缓解BMECs氧化应激的机理。试验一结果得出,不同剂量的Se对过量NO诱导的BMECs氧化损伤具有不同程度的减缓作用,且表现出显著的剂量依赖效应,增加了 GPX、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)、总抗氧化酶(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活性以及GPX、TrxR、PPARγ的基因表达;激活了 Nrf2信号通路的基因表达;抑制了炎症通路NF-κB的活化,降低了丙二醛(MDA)含量、活性氧(ROS)以及炎症因子白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、抗肿瘤坏死因子(TNF-α)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的活性及基因表达。综合多项指标,当Se添加剂量为50～100nmol/L时对氧化应激的减缓作用较好,添加剂量为50 nmol/L时,减缓效果最好。试验二的结果得出,在Se+DETA组中添加GW2.5抑制剂后,与Se+DETA组比,发现PPARγ基因表达量被显著抑制,抗氧化酶GPX、T-AOC、T-SOD、CAT酶活性,TrxR、SelP的mRNA水平及酶活性均显著降低(P<0.01);炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及NF-κBp50的基因表达量均显著升高,且MDA、NO含量,ROS及iNOS活性也呈相似的变化规律。表明当PPARγ被抑制,Se不能发挥其抗氧化功能,说明Se是通过激活PPARγ,抑制NF-κB信号通路的活化,降低炎症因子的生成,减少NO生成,进而发挥减缓氧化应激的作用。试验三结果得出,沉默了 GPX1的Se+DETA组显著抑制了 Se+DETA组的PPARγ、Nrf2的基因表达量,降低了抗氧化酶GPX1、TrxR的mRNA水平及酶活性和T-AOC、CAT的活性,显著升高了 NF-κBp65的基因表达量和炎症因子IL-1β、TNF-α与iNOS基因表达量及酶活性,且ROS活性,MDA、NO含量也呈相似的变化规律(P<0.01)。表明GPX1是Se发挥抗氧化功能的关键基因,GPX1基因被沉默后,可抑制细胞中PPARγ的基因表达,激活NF-κB信号通路,进而增加下游炎症因子的浓度及基因表达量,削弱了 Se对细胞的抗氧化功能。综上所述,本论文从Nrf2/GPX1-PPARγ-NF-κB信号通路探讨了 Se对过量的NO诱导的BMECs氧化应激的减缓作用与机理,即Se是通过激活信号通路Nrf2,促进了 GPX1的基因及其酶活性的升高,增加了 PPARγ的基因表达,抑制了 NF-κB信号通路的激活,降低炎症因子IL-1β的释放,进一步减少NO的过量生成,进而起到保护细胞免受氧化应激的作用。