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骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤,具有高度遗传异质性,伴随着病因的复杂性、基因组的不稳定性、核型的高度异常化以及多基因突变,为骨肉瘤的研究和治疗带来许多阻碍。前期研究结果证实,人体内的骨肉瘤细胞可以通过去分化获得干细胞特性。与成熟的骨肉瘤细胞相比,去分化后的细胞具有更强的自我更新能力、多向分化潜能以及更强的体内成瘤能力,并体现出对化疗药物的耐受性,从而影响患者的预后。该发现证实了骨肉瘤细胞具有可塑性,进一步完善了经典的肿瘤干细胞理论,但其中的分子调控机制尚未阐明。因此,本研究旨在解析骨肉瘤细胞去分化过程中的关键调控因素及相关信号通路,为骨肉瘤的去分化研究提供新的线索,对骨肉瘤靶向性治疗的发展具有重要的临床意义。microRNA-34a(miR-34a)在骨肉瘤的去分化过程中起负反馈调节的作用。研究发现三株不同遗传背景及表型的骨肉瘤细胞系具有不同的去分化能力,其中p53突变型的MNNG/HOS去分化效率高于p53缺失型的MG-63,而p53野生型的U-2 OS则无法在体外去分化形成具有干细胞特性的球囊。临床数据指出,约20%的骨肉瘤患者内p53基因有异常突变的情况。作为p53的直接下游靶分子,miR-34a在临床骨肉瘤患者中显著下调,伴随着缺失和表观遗传上的失活,可能起到抑癌因子的作用。qRT-PCR检测发现,miR-34a在MNNG/HOS和MG-63细胞的去分化过程中显著上调,且被骨肉瘤微环境关键因素转化生长因子(Transforming growth factor,TGFβ1)显著激活。同时,U-2 OS细胞内miR-34a的表达水平显著高于MNNG/HOS和MG-63细胞。进一步分析miR-34a的具体作用发现,过表达miR-34a可以有效阻碍MNNG/HOS和MG-63细胞的去分化进程,抑制miR-34a可以促进其去分化。此外,敲除miR-34a后U-2 OS内干性基因SRY-related-HMG box(Sox)2的表达水平显著上调,并能在脂肪分化诱导培养后形成成熟的脂肪细胞,在显微镜下能观察到脂肪滴的形成,并通过qRT-PCR检测到脂肪生成标志基因的上调。说明敲除miR-34a的U-2 OS获得了一定的分化能力。Plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1)作为miR-34a的下游直接靶基因,参与调控骨肉瘤细胞的去分化。为了进一步分析miR-34a调控骨肉瘤去分化的相关机制,我们通过microarray的数据分析在骨肉瘤细胞去分化过程中发生显著变化的基因。芯片结果、qRT-PCR和western blot检测均表明,PAI-1在去分化过程中被TGFβ信号通路显著激活。抑制PAI-1的表达能显著抑制球囊细胞的形成,有效阻碍骨肉瘤细胞的去分化。基于Targetscan和miRBase的数据库预测分析发现,PAI-1的3’UTR与miR-34a种子序列相匹配。qRT-PCR和western blot检测发现,PAI-1的表达水平会随miR-34a的变化而改变。双荧光素酶报告基因进一步验证,在骨肉瘤细胞内过表达miR-34a能抑制含PAI-1 3’UTR结合位点报告基因的荧光素酶活性,而将与miR-34a结合的部分碱基突变后,过表达miR-34a则不再引起荧光素酶活性的下调。miR-34a通过对PAI-1的直接调控引起骨肉瘤细胞内Sox2的表达变化,从而影响其去分化。为了进一步了解PAI-1对骨肉瘤去分化的作用机制,我们试图探究其下游效应分子。研究发现,PAI-1能结合到干性基因SOX2的启动子区域,影响其转录,进而影响肿瘤细胞的干细胞特性。与PAI-1趋势一致的是,在MNNG/HOS和MG-63细胞的去分化过程中Sox2均显著上调。抑制PAI的表达可以使MNNG/HOS和MG-63细胞内的Sox2下调,还能抑制敲除miR-34a后的U-2 OS内Sox2的显著性上调。而过表达miR-34a能同时抑制MNNG/HOS和MG-63内PAI-1与Sox2的mRNA水平。此外,在MNNG/HOS和MG-63细胞内过表达Sox2可以挽救PAI-1抑制剂引起的去分化阻滞作用。利用骨脱细胞外基质材料(Bone extracellular matrix,BEM),在体外构建与临床病理学特征十分相近的骨肉瘤组织,并利用该模型验证了骨肉瘤细胞去分化的调控机制。为了更好地模拟骨肉瘤的微环境,解析微环境信号对骨肉瘤发生发展的调控机制,本实验室成功构建了小鼠胫骨脱细胞外基质材料,为骨肉瘤细胞的体外培养提供接近体内的生长环境。结果发现,在BEM的不同部位,骨肉瘤的形态和基因表达有明显的差异,可分化成不同形态的细胞亚群,展示出与临床病理切片相似的异质性。其中,较为细长的梭形细胞内PAI-1的表达较弱,而另一种卵圆形细胞内PAI-1的表达较强。指示不同形态的骨肉瘤细胞可能代表着不同的分化程度。此外,去分化后的骨肉瘤细胞在BEM中展现出PAI-1和Sox2的高水平表达,印证了在细胞水平得出的结论,即PAI-1–Sox2信号通路作为抑癌分子miR-34a的下游与骨肉瘤细胞的去分化息息相关。综上所述,本研究基于骨肉瘤高度异质性的特点,采用三种不同p53遗传背景的细胞系为研究对象,分析在骨肉瘤细胞去分化过程中miR-34a及其下游靶分子的作用机制。结果发现,在骨肉瘤的去分化过程中,经典抑癌因子miR-34a被激活上调,意图抑制去分化过程,起到负反馈调节的作用。miR-34a可以通过对PAI-1的直接调控引起骨肉瘤细胞内Sox2的表达变化,从而影响其去分化。此外,本研究采用的骨肉瘤BEM模型保留了完好的胞外基质微环境,培养其中的骨肉瘤细胞展现出与临床病理特征一致的异质性,为体外研究骨肉瘤的生物学特性提供具有良好生物相容性的模型。本研究更深层次地解析miR-34a对骨肉瘤去分化的调控机制,为探究骨肉瘤细胞的生物学特性奠定良好的基础,并为今后的临床诊断和治疗策略提供新的视角。