第一部分:蛇床子素对UUO小鼠肾纤维化的保护作用目的:肾纤维化形成是各种肾损伤疾病的终末发展阶段,最终引起慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)。CKD病人约占世界人口的10%以上,然而目前的治疗方式仍比较局限。蛇床子素(osthole,OST)是天然香豆素类化合物,存在于伞形花科植物中。OST具有广泛的药理学作用,如抗炎、抗氧化、抗癌、舒张血管等。研究表明,离体或在体模型中,OST对肺、心肌、肝脏及皮肤瘢痕纤维化均有保护作用,且对肾纤维化形成中的关键信号通路TGFβ1/Smad有调控作用。肾脏组织中,OST在急性-缺血再灌诱导的肾损伤、IgA肾病及局部肾小球硬化的动物模型中均有一定的改善作用。因此,本部分的研究拟探讨OST对肾纤维化这一病理特征是否有改善作用。方法:研究采用单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)的肾纤维化模型。C57BL/6小鼠左侧输尿管手术结扎构建UUO模型。OST(40及80 mg/kg/d)给药组在UUO手术前1天进行灌胃给药,并在术后连续1次/天给药。假手术组进行手术但并未采取输尿管结扎,且等体积的5%羧甲基纤维素钠溶液(OST助溶剂)灌胃,给药方式同OST组。苏木素-尹红(Hematoxylin-eosin,HE)和马松三色法(Massontrichrome,MTC)染色检测不同组中肾脏结构组织的形态及胶原纤维沉积状况,观察各组小鼠UUO术后7天的肾脏纤维化情况,并探讨OST对肾纤维化的作用。生化仪检测血清中肌酐(Creatinine,Cre)、血尿氮(blood uria nitrogen,BUN)的含量,观察不同OST剂量对UUO模型中肾脏功能的影响;Real-time PCR 法及 CD68 的免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)染色法观察不同组中肾组织炎症因子mRNA的表达水平及巨噬细胞的累积水平;蛋白斑点(Western blot)、IHC 染色及免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)法检测初步探讨OST对肾纤维关键信号通路TGFβ1及其下游信号通路(Smad与非Smad信号通路)的可能调控作用。结果:UUO术后7天,OST(40及80 mg/kg/d)给药组明显改善肾脏的结构形态、减少肾盂扩张及肾皮质与髓质的总体积、肾胶原纤维的沉积。UUO7天,OST不同剂量给药对小鼠肾功能并无明显影响作用。此外,OST给药组均有效改善肾纤维化过程中炎症分子mRNA的含量及巨噬细胞的累积。且OST对肾脏纤维化发展过程中的重要信号通路TGFβ1/Smad有明显的抑制作用,而对MAPK信号通路无明显作用。结论:OST对小鼠UUO模型中的肾纤维化有明显改善作用,有效缓解肾纤维化中的炎症状况,抑制促纤维化信号通路TGFβ1/Smad的激活。本部分的研究从形态学及信号机制的初步探讨中充分证实OST对肾脏组织纤维化的保护作用,提示OST可以作为治疗CKD的潜在药物。第二部分:蛇床子素对UUO小鼠及肾成纤维细胞激活与增殖作用的研究目的:成纤维细胞及肌成纤维细胞(平滑肌肌动蛋白α(α-smooth muscle actin,α-SMA)阳性的纤维细胞)是肾纤维化形成过程中的关键细胞,负责合成及累积细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)成分,引起肾纤维并导致肾实质结构功能的破坏。现有研究表明,OST减少小鼠心肌成纤维细胞与肝星形细胞的激活与ECM的合成、抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖。因此,我们提出假设,OST通过抑制肾成纤维细胞的激活与增殖,从而改善UUO诱导的肾纤维作用。方法:在体模型中,C57BL/6小鼠UUO造模7天,OST给药组及假手术组给药方式同第一部分。采用免疫荧光法双染α-SMA及ki-67法,检测中各组小鼠中肾肌成纤维细胞的激活与增殖情况。离体模型中,采用肾纤维化研究中较常见、易得的大鼠成纤维细胞(NRK-49F)细胞系为研究对象,用TGFβ1(5ng/ml)给予刺激,构建肾纤维化细胞模型。OST(10、20、40 μM)预孵育NRK49F,培养12 h或24 h,观察OST对肾成纤维细胞的增殖作用,并探讨各细胞组别中增殖相关的细胞循环调控蛋白的表达水平。此外,实验采用免疫荧光、Western blot及Co-IP法观察NRK49F模型中,OST对肾成纤维细胞激活作用及ECM相关蛋白的表达,并探讨此过程中OST对TGFβ1下游信号通路的调控情况。结果:研究发现,UUO引起的小鼠肾纤维化过程中,肌成纤维细胞大量激活与增殖;OST给药后能明显减少肾脏组织中肌成纤维细胞的激活与增殖。相应的,在TGFβ1刺激的NRK49F细胞系中,与TGFβ1刺激的模型组相比,OST预孵育后显著减少NRK49F的增殖,且以OST 40 μM剂量抑制作用最为明显;OST 40uM有效逆转TGFβ1刺激下细胞增殖与细胞循环相关蛋白PCNA、cyclin D1及p21 Waf1/Cip1的表达水平。同样,与TGFβ1刺激的模型组相比,OST预孵育剂量依赖型的抑制NRK49F的激活并减少ECM相关蛋白的表达水平;且同第一部分OST对在体小鼠肾纤维化模型中对TGFβ1下游信号通路的调控作用相一致,OST选择性抑制NRK49F中TGFβ1/Smad信号通道的激活,并不影响MAPK信号通路的激活。结论:本部分的研究表明,在体及离体模型中,OST均显著抑制肾(肌)成纤维细胞的激活与增殖;且OST选择性抑制肾成纤维细胞激活中TGFβ1/Smad信号通路。研究结果提示,OST抑制成纤维细胞的激活及增殖作用可能是OST减轻肾纤维化的机制之一。第三部分:蛇床子素对UUO小鼠及肾小管上皮细胞间质转分化作用的研究目的:慢性肾损伤条件下,肾小管上皮细胞间质转分化(Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)的过程不仅影响肾脏的正常功能而且该形态转化引起大量促纤维化因子或生长因子的分泌,为纤维化提供重要的局部微环境,加速纤维化的进展。研究表明,OST均逆转脑癌、乳腺癌及肺癌细胞中的EMT过程;显著抑制EMT的促转录因子Snail、Twist的表达;从而改变上皮细胞及间质细胞的标记物E-钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表达水平。考虑到肿瘤的“Type 3 EMT”与组织纤维化的“Type 2 EMT”发展过程中共有一些关键的转录因子及信号通路。此外,在第一部分研究中已证实OST可抑制在体UUO小鼠肾小管细胞中TGFβ1/Smad3信号通路,而TGFβ1/Smad3信号通路对于肾小管的EMT现象有重要作用。因此,我们提出假设,OST通过抑制肾小管上皮细胞EMT过程,从而改善UUO诱导的肾纤维作用。方法:在体模型中,C57BL/6小鼠UUO造模7天,OST给药组及假手术组给药方式同第一部分。通过Western blot及IHC方法,观察不同组别中小鼠肾脏EMT转录因子Snail-1、Twist-1、E-cadherin及Vimentin蛋白的表达水平。离体模型中,采用TGFβ1(10 ng/ml)处理人肾小管(HK-2)细胞构建EMT模型,光学显微镜下观察细胞形态学的变化;检测各组细胞中与EMT相关的E-cadherin、Vimetnin、Snail-1、Twist-1 及炎症因子 TGFβ 1、PDGF-B 的 mRNA 与蛋白表达含量,观察OST预处理对HK-2细胞的EMT过程及细胞分泌的促纤维化因子的影响。IHC法与细胞流式法分别检测肾脏组织及HK-2细胞中与EMT密切相关的肾小管G2/M期细胞阻滞情况。共同检测肾脏组织及HK-2细胞中MAPK、p-Smad3,Akt及β-catenin信号通路相关蛋白的表达水平,观察OST改善肾纤维化EMT过程的可能分子作用靶点。结果:在体小鼠肾纤维化模型中,OST显著改善肾小管细胞E-cadherin、Vimentin的表达,减少促转录因子Snail-1、Twist-1的蛋白含量及G2/M期的细胞标记物phospho-histone H3(p-H3)的分布及表达情况。离体HK-2细胞中,与TGFβ1组相比,OST预孵育同样阻止TGFβ1刺激诱导的EMT过程、减少HK-2细胞促纤维化因子的分泌、并减少细胞G2/M期的阻滞。离体及在体模型中均观察到OST调控EMT相关的p-Smad3、Akt及β-catenin信号通路,然而对MAPK信号通路无显著改善作用。结论:在体及离体模型中,OST均显著抑制肾纤维化中肾小管EMT过程且阻止肾小管上皮细胞EMT中p-Smad3、Akt及β-catenin信号通路的激活。该部分结果提示,OST抑制肾小管EMT过程作用可能是OST减轻肾纤维化的机制之一。