冻存卵巢移植中的ERS及FSH干预作用的研究

来源 :宁夏医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:sunday_rectina
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目的:  本实验通过玻璃化冻存小鼠卵巢移植小鼠肾被膜下后,检测不同时段卵巢中内质网应激(ERS)分子伴侣GRP78、凋亡相关蛋白CHOP、Caspase-12的表达水平,探讨冻存移植过程中是否激活了卵巢内ERS,以及移植后卵巢早期发育中存在的卵泡丢失是否与ERS途径介导的细胞凋亡相关联,采用FSH干预,探究其干预效果。  方法:  4周龄C57BL/6J雌性间期小鼠,取其双侧卵巢,剥离外膜后纵向对切成两半,随机分为新鲜组、空白组、TM组、保护剂渗透组、冻存组、TUDCA干预冻存组、FSH干预冻存组。各组培养后行肾被膜下移植术,术后监测受体鼠动情周期的恢复情况,并且在术后2天、4天、6天、28天取材,制作石蜡切片。HE染色观察,移植后28天每组卵巢卵泡的形态,并做正常卵泡计数。并且采用免疫组织化学法检测移植后2天,4天,6天分组中内质网应激伴侣分子GRP78、凋亡相关蛋白CHOP、Caspase-12蛋白表达,Western blotting技术检测GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表达水平。TUNEL法检测各组卵巢内细胞凋亡水平。移植后28天取小鼠血清检测血清中E2和FSH含量。  结果:  (1)常规玻璃化卵巢冻存移植后,各组卵泡计数结果显示TM组、冻存组和保护剂渗透组卵泡计数明显低于空白组(P<0.05);动情周期恢复情况显示TM组、冻存组和保护剂渗透组动情周期的恢复时间明显比空白组延长(P<0.05),冻存组恢复时间最长(P<0.05);激素水平测定结果显示:各组E2浓度无明显差异(P>0.05)。  (2)冻存过程加入FSH干预后,FSH干预冻存组、TUDCA干预冻存组卵泡计数明显高于单纯冻存组(P<0.05),其动情周期恢复时间也明显比冻存组缩短(P<0.05);激素水平测定显示:FSH干预冻存组、TUDCA干预冻存组E2激素含量高于单纯冻存组(P<0.05);  (3)凋亡检测结果显示:常规玻璃化冻存卵巢移植后2天、4天凋亡较强,6天减弱。移植后的第2天、4天,冻存组凋亡明显强于其余各组(P<0.05);加入FSH干预冻存后,相同时间点,FSH干预冻存组、TUDCA干预冻存组的卵泡凋亡明显减弱(P<0.05),且FSH干预冻存组凋亡程度明显低于TUDCA干预冻存组(P<0.05);  (4)常规玻璃化冻存移植后检测各组ERS标志蛋白,免疫组织化学结果显示GRP78蛋白主要表达于卵泡的颗粒细胞胞浆中,其表达在移植后的第2天达到高峰,4天开始减弱。移植后第2天、第4天,冻存组、保护剂诱导组、TM组GRP78蛋白的表达明显高于空白组(P<0.05),Western blotting蛋白定量结果显示了相同的趋势;CHOP蛋白主要定位于卵母细胞和颗粒细胞胞浆中,在移植后的第2天,第4天表达高峰,第6天减弱。移植后第2天冻存组、保护剂渗透组、TM诱导组的CHOP表达明显高于空白组(P<0.05);Caspase-12蛋白主要定位于颗粒细胞及间质细胞胞胞浆中,在移植后的第2天,第4天表达达高峰,第6天减弱。移植后第2天,冻存组、保护剂渗透组、TM组Caspase-12明显高于空白组(P<0.05);  (5)常规玻璃化冻存过程中加入FSH干预后,移植后第2,4天,Western blotting蛋白定量结果显示FSH干预冻存组和TUDCA干预冻存组GRP78蛋白的表达量明显低于冻存组(P<0.05),但仍高于空白组(P<0.05);TUDCA干预组CHOP和Caspase-12蛋白表达明显低于冻存组(P<0.05),但FSH干预组与冻存组相比没有明显差异;  结论:  1.冻存卵巢移植后的生长早期发生了内质网应激,在移植后的第2天最强。发育的第4天,内质网应激保护途径已经转向了凋亡途径。移植后的卵泡发育过程中的卵泡丢失跟内质网应激相关。  2.FSH的干预可以提高冻存移植卵巢的正常卵泡数,而且缩短了受体鼠动情周期的恢复时间,有利于其E2激素水平的恢复;FSH的干预可以减少卵巢冻存移植过程中的卵泡凋亡;通过对内质网应激标志分子的检测结果显示,FSH减弱内质网应激的效果并不明显,其缓解冷冻移植卵巢的凋亡作用还应有其他途径介导。
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