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研究背景及目的:三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)是指是雌激素受体(estrogenreceptor,ER)、孕激素受体(progestrone receptor,PR)以及人类表皮生长因子(human epidermal growth factor receptor 2,Her-2)均为阴性的一类乳腺癌,约占乳腺癌患者人数的10-20%,预后较差,目前化疗是TNBC手术后最主要的辅助治疗方式。PIK3CA基因突变通过PI3K/Akt途径引起Akt的持续活化,可促进细胞的生长和转化,并抑制细胞凋亡,与多种人类实体肿瘤的发生发展关系密切。PIK3CA的突变频率在乳腺癌中是仅次于TP53突变,且主要发生在激酶区和螺旋区两个热点区。TNBC比其他类型乳腺癌对化疗药物更敏感,更容易获得病理完全缓解。我们前期的临床研究结果显示,PIK3CA突变的TNBC患者新辅助化疗后肿瘤残存比率高,随访预后很差,提示PIK3CA突变可能和TNBC化疗耐药有关。目前PIK3CA突变对乳腺癌患者预后的影响的研究多集中在激素阳性乳腺癌或者Her-2扩增型乳腺癌,而对TNBC预后影响的研究比较少。本研究旨在探究PIK3CA突变在TNBC中的作用以及对TNBC耐化疗药物的分子机理,为TNBC的防治提供理论依据,为新药筛选提供新的方向,并为临床应用奠定基础。方法:1.体外实验:利用慢病毒感染TNBC细胞株MDA-MB-231和MDA-MB-468建立PIK3CA突变型和野生型的TNBC细胞系,用CCK-8试验绘制感染后各细胞系的生长曲线,流式观察分析比较各细胞系细胞周期和细胞凋亡情况,Transwell侵袭实验检测比较各细胞系的侵袭能力,并用Western blot、实时定量PCR、免疫组化等方法检测表柔比星处理前后各细胞系PI3K/Akt/mTOR信号通路上p110α、akt、p-akt、mTOR、pten、xiap、Ki67、p53、Bcl-2 等的表达情况以明确 PIK3CA突变在TNBC细胞中的作用和PIK3CA突变与化疗耐药的关系及作用机制。2.体内实验:用上述感染后MDA-MB-231细胞系建立PIK3CA突变型和野生型TNBCNOD-SCID小鼠模型,给小鼠注射表柔比星,并定期测量小鼠肿瘤生长情况,后期处死小鼠取出肿瘤组织,分别用Western blot、实时定量PCR、免疫组化等方法检测PI3K/Akt/mTOR信号通路上p110α、akt、p-akt、mTOR、pten、xiap、Ki67、p53、Bcl-2等的表达情况以验证PIK3CA突变在TNBC细胞中的作用和PIK3CA突变与化疗耐药的关系及作用机制。3.临床回顾性分析:收集50例在我院手术的TNBC患者的临床病理资料,并对她们的肿瘤组织进行测序,根据测序结果分为PIK3CA突变组和野生型组。同时对她们的肿瘤组织进行免疫组化分析,结合随访结果,对两组TNBC的各临床病理特征因素进行单因素分析,探讨PIK3CA突变对TNBC患者的影响。结果:1.体外实验:(1)PIK3CA突变型MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系较野生型生长加快,且S期细胞比例增多(P>0.05),凋亡细胞明显减少(P<0.05);(2)Transwell实验结果:PIK3CA突变型细胞系穿过Transwell小室的细胞数较野生型明显增多(P<0.05),提示PIK3CA突变增强了 TNBC细胞的侵袭能力;(3)PIK3CA突变型MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系较野生型,Akt磷酸化增多,pten、Ki67、Xiap、p-p53 表达上调,Stat3、p-4E-BP1、Caspase3、Bcl2、p53 表达下调;(4)细胞凋亡实验显示:表柔比星处理后PIK3CA突变型MDA-MB-231细胞系凋亡数减少(P<0.05);但MDA-MB-468细胞系只有PIK3CA过表达细胞系凋亡数减少有统计学意义(P<0.05);(5)Western blot实验结果:表柔比星处理后PIK3CA突变型MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞系,Akt磷酸化增加,mTOR、磷酸化mTOR、Ki67、Xiap表达上调。2.体内实验:(1)接种PIK3CA突变型MDA-MB-231细胞系小鼠肿瘤生长较接种野生型细胞系的要快,且肿瘤平均体积也要大(P<0.05);(2)肿瘤组织Western blot、免疫组化实验结果:PIK3CA突变型TNBC小鼠肿瘤组织中,Akt磷酸化增多,mTOR、Xiap、Ki67、p53 表达上调,Caspase3、Bcl2、pten 表达下调。3.临床回顾性分析:(1)50例患者中11例(22%)肿瘤发生PIK3CA突变,其中有8例在H1047R位点,1例在E545K位点;(2)PIK3CA突变型与PIK3CA野生型在年龄分布、肿瘤大小、肿瘤部位、腋窝淋巴结状态、组织学分级、TNM分期、复发、肿瘤转移、术后生存、家族肿瘤史、p53表达、Ki67指数上均无统计学差异(P>0.05);(3)PIK3CA突变肿瘤组织中,Akt、mTOR高表达,pten、Bcl-2在野生型及PIK3CAE545K中表达较高,而在PIK3CAH1047R中表达则相对要低,Xiap、CyclinD1、Caspase3在野生型和突变型肿瘤组织中表达无差异。结论:本研究结果初步表明:1.体外实验:(1)PIK3CA突变促进TNBC细胞生长;(2)PIK3CA突变增强TNBC的侵袭能力;(3)PIK3CA突变会抑制TNBC细胞凋亡;(4)PIK3CA突变增强TNBC对化疗药物的抵抗力;(5)PIK3CA突变会激活PI3K/Akt/mTOR信号通路,促进细胞的生长。2.体内实验:(1)PIK3CA突变促进TNBC小鼠的成瘤及肿瘤生长;(2)PIK3CA突变通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路,促进肿瘤成长。3.临床回顾性分析:(1)PIK3CA突变在TNBC中的突变频率为22%,且主要集中在E545K、H1047R位点;(2)PIK3CA突变可能不能作为三阴性乳腺癌预后的预测因子。