骨髓间充质干细胞在淋巴细胞参与下影响HBV复制的体外研究

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目的探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM MSCs)在体外淋巴细胞参与下对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制的影响及其机制的初步研究。方法(1)选用体重80-100g BN大鼠,应用全骨髓培养/贴壁分离筛选法,分离、培养并扩增BM MSCs,应用流式细胞术对所培养的第3代细胞进行表面标记分子鉴定,并通过诱导培养分化为脂肪、成骨细胞,检测BM MSCs的分化能力。(2)细胞共培养:选取状态良好的第三代BM MSCs,提取BN大鼠新鲜的脾淋巴细胞,选择培养状态良好的Hep G 2.2.15细胞,采用Transwell小室做细胞共培养。实验分组:共5组,第1组为单纯脾淋巴细胞组;第2组为单纯Hep G 2.2.15细胞组;第3组为BM MSCs+Hep G2.2.15细胞组;第4组为脾淋巴细胞+Hep G2.2.15细胞组;第5组为脾淋巴细胞+BM MSCs+Hep G 2.2.15细胞组。(3)在共培养24 h、48 h及72 h后,采用MTT法对脾淋巴细胞及贴壁细胞进行细胞活性检测,实时定量PCR测定上清液中HBV DNA水平、Hep G 2.2.15细胞内HBV ccc DNA水平及BM MSCs中的HBV ccc DNA水平,流式细胞术对T淋巴细胞亚群的比例变化进行检测,应用ELISA法检测上清液中细胞因子IFN-γ、IL-10水平。结果(1)BM MSCs鉴定:在体外成功提取并扩增BM MSCs,对所提取的细胞进行鉴定,其具备典型的MSCs的形态特点,培养到第3代细胞进行表面标记分子学鉴定,结果显示:CD29、CD90、RT1A表达的阳性率分别为97.0%、96.3%和96.3%,而CD34、CD45、RT1B阴性率均>95%,且经诱导培养分化后,所提细胞经诱导培养能够成功分化为成骨细胞(经由von kossa染色后在显微镜下可以观察到黑色钙盐沉积)及脂肪细胞(经由油红O染色后显微镜下可观察到细胞胞浆内呈红色脂滴)。(2)检测BM MSCs对HBV复制的影响:在体外细胞培养的环境下HBV DNA及HBV ccc DNA在24 h、48 h及72 h时,与第2、3和4组比较,第5组HBV DNA的表达水平明显降低,且在48h时差异显著,HBV DNA:(181.000±14.731)IU/m L vs(6270.000±300.450)IU/m L、(2564.000±231.058)IU/m L、(2433.300±302.379)IU/m L;HBV ccc DNA:(4.330×105±0.464×105)IU/m L vs(11.100×105±0.375×105)IU/m L、(8.930×105±0.778×105)IU/m L、(9.850×105±0.810×105)IU/m L,P<0.01;各组BM MSCs中均未检测出HBV ccc DNA的复制。(3)BM MSCs对HBV复制影响机制:细胞因子检测结果,上清中淋巴细胞及BM MSCs分泌IFN-γ的水平与HBV DNA水平呈负相关(淋巴细胞24 h:r=-0.900;48 h:r=-0.982;72 h:r=-0.968,P<0.05。BM MSCs 24 h:r=-0.828;48 h:r=-0.922;72 h,r=-0.828,P<0.05),而IL-10水平与HBV DNA水平呈正相关(24 h:r=0.860,48 h:r=0.972,P<0.05)。T细胞亚群检测,结果显示CD4+/CD8+比例有所升高,且经相关性分析,共培养后淋巴细胞表面标志CD8+细胞的百分率与HBV DNA水平呈正相关(24 h:r=0.865,48 h:r=0.766,72 h:r=0.912,P<0.05)。结论成功从BN大鼠股骨、胫骨中提取BM MSCs,并于体外培养,通过细胞形态、细胞表面分子标记以及诱导分化能力这三方面进行验证,符合BM MSCs的典型特征,在淋巴细胞参与下可以抑制HBV DNA的表达;影响HBV的复制,可能的影响机制是BM MSCs通过自身分泌IFN-γ等细胞因子,及通过调节Tc1/Tc2平衡等方式实现的。
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