论文部分内容阅读
牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus, BVDV)是黄病毒科瘟病毒属成员,除感染牛外,它还能引起猪、羊、鹿以及多种野生动物发病。近年来,猪群感染BVDV的现象日益严重,而且主要是持续性感染。如果母畜在孕期前30-120天内感染非致细胞病变型(noncytopathic, NCP) BVDV,此时胎儿免疫系统尚未发育完全,不能识别外源NCP型BVDV为抗原,因此容易造成胎儿持续感染BVDV,成为主要传染源之一。研究表明只有NCP型BVDV感染才能产生持续性感染,而病毒逃逸细胞先天免疫是建立细胞持续感染的第一步。因此,了解猪源BVDV逃逸细胞先天免疫的机制,有助于我们解释BVDV持续性感染的作用机制,从而制定更全面的BVDV防控措施。ISG15(interferon-stimylated genel5, ISG15)是泛素样蛋白(UBL)家族的重要成员,与干扰素有密切关系,是干扰素诱导表达最强的ISG之一,也是第一个被鉴定的ISG。ISG15可抑制多种DNA病毒和RNA病毒的增殖,在抗病毒免疫中具有不容忽视的地位,现已证明ISG15在抗1型HIV病毒、埃博拉病毒、乙型流感病毒等多种病毒过程中起重要作用。本研究通过克隆牛源ISG15基因,高效表达重组蛋白并制备抗ISG15多克隆抗体；同时构建稳定表达ISGl5蛋白的细胞系。在此基础上,探析了猪源BVDV-2与ISG15蛋白的相互作用,为进一步研究ISG15抗病毒机制和猪源BVDV-2逃逸细胞先天免疫机制奠定了基础。研究的主要内容分为以下3部分：1.ISG15基因的原核表达及多抗血清的制备本试验利用人重组干扰素IFNа-2A刺激MDBK细胞,并提取细胞总RNA。通过RT-PCR扩增牛干扰素刺激基因ISG15,将其克隆入pCold-TF表达载体中,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达后,获得约70KDa的可溶性ISG15重组蛋白并用试剂盒进行纯化。经BCA法测定纯化的ISG15重组蛋白浓度为1mg/ml。用纯化的ISG15重组蛋白免疫ICR小鼠,制备抗ISG15多抗血清；四免后断尾采血,用间接ELISA方法测定多抗血清效价为1：102400。Western blot鉴定表明,ISG15多抗血清能特异性识别纯化的ISG15重组蛋白。2.稳定表达ISG15蛋白的细胞系的构建与鉴定本研究构建了稳定表达ISG15蛋白的MDBK细胞系,为进一步研究ISG15蛋白与猪源BVDV-2的相互作用奠定基础。通过RT-PCR扩增ISG15基因片段,将其克隆到真核表达载体pEC129中,筛选出阳性重组真核表达质粒pEC129-ISG15。利用Lipofectamine LTX and PlusTM Reagent试剂盒将pEC129-ISG15转染MDBK细胞并用终浓度为700μg/mLG418进行筛选。约两周后,将筛选获得的单克隆细胞团进行扩大培养并传代。利用ISG15多克隆抗体对传至第十代的筛选细胞系进行间接免疫荧光检测,发现整个视野内的细胞都能激发绿色荧光。Western blot鉴定结果亦表明,ISG15多克隆抗体能与第十代筛选细胞系的总蛋白发生特异性反应,经DAB显色后出现一条约15KDa的条带。上述结果说明我们成功构建并筛选出了稳定表达ISG15蛋白的MDBK细胞系,命名为E53,为后续实验顺利开展奠定了良好基础。3.ISG15和猪源BVDV-2相互作用探究本研究旨在探究ISG15蛋白与猪源BVDV-2的相互作用关系,为后续研究猪源BVDV-2逃逸细胞先天免疫机制奠定基础。将猪源BVDV-2分离株SH-28分别感染MDBK细胞和稳定表达ISG15蛋白的E53细胞后,收集不同时间点的病毒液并测定其TCID50;绘制SH-28在不同细胞系中的病毒滴度增殖曲线图,发现ISG15蛋白对SH-28的复制有明显抑制作用。利用荧光定量PCR检测SH-28感染后E53细胞内ISG15蛋白的表达情况,结果表明,与空白对照相比较,SH-28感染E53细胞后细胞内ISG15蛋白表达量大幅增加,说明猪源BVDV-2感染能显著提高ISG15蛋白的表达。为探析ISG15蛋白对猪源BVDV-2抑制I型干扰素表达的影响,用poly I:C分别处理MDBK细胞和E53细胞后,再感染SH-28,然后用荧光定量PCR检测细胞内IFN-α和IFN-β的表达量。结果表明SH-28感染MDBK细胞后使细胞内IFN-α和IFN-β的表达量分别下降约2.49倍和3.31倍,而在E53细胞中,SH-28感染使IFN-α和IFN-β的表达量分别下降约6.29倍和9.71倍,说明过量表达ISG15蛋白能够促进猪源BVDV-2对IFN-I的抑制作用,但具体作用机制还有待进一步研究。