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成纤维细胞生长因子家族(Fibroblast Growth Factors,FGFs)在哺乳动物中由22个结构相关的蛋白质组成,这些蛋白质具有约120个氨基酸序列的同源性,大多数FGF配体通过结合和激活细胞表面的酪氨酸激酶受体FGFR家族将信号传递到胞内,调控细胞的增殖、存活、迁移、分化、凋亡和代谢。因FGFs存在的重要功能,其在脂肪组织发育和脂肪代谢中的作用也备受学者关注。FGF9是FGFs中的重要成员之一,广泛表达于各组织和细胞中,通过与受体FGFR2和FGFR3结合参与血管形成、胚胎发育、损伤修复等多种生理过程。目前FGF9相关研究多集中在骨骼发育、性腺分化以及癌症发生等领域,有少量研究报道指出FGF9 m RNA在人和小鼠的脂肪组织中高表达,而关于FGF9在山羊肌内脂肪细胞分化中的作用鲜有报道。NCBI上仅见山羊FGF9基因的预测序列,难以为畜牧学研究提供可靠的基础数据。因此,本研究旨在利用RT-PCR技术克隆山羊FGF9基因序列,并通过细胞培养、干扰和超表达等方法探究FGF9对山羊肌内脂肪细胞分化的影响。主要研究结果如下:(1)克隆获得山羊FGF9基因序列818 bp,包括627 bp CDS区,编码208个氨基酸。获得Gen Bank登录号:MH358358。FGF9在山羊各组织中广泛表达,且在肾脏中表达量最高,极显著高于其他被测组织(P<0.01),小肠组织次之,肝脏和脾脏最低。(2)随着山羊肌内脂肪细胞分化的进行,FGF9的表达在0-5 d逐渐升高,并在诱导分化的第6 d升至最高且极显著高于其他分化阶段(P<0.01)。(3)FGF9-si RNA2干扰效率达64%(P<0.01)。干扰FGF9后,山羊肌内脂肪细胞中脂滴的积聚增加,甘油三酯含量也显著升高(P<0.05)。同时,干扰FGF9使脂肪细胞分化标志基因PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、SREBP1表达上调,其中PPARγ的表达达到极显著水平(P<0.01),而抑制分化的基因Pref1则极显著下调(P<0.01);与脂肪酸从头合成相关的ACACA和FASN极显著上调约达30倍(P<0.01)和50倍(P<0.01),与脂肪酸转运相关的FABP3也极显著上调达62倍(P<0.01),与甘油三酯合成相关的DGAT1轻微上调而GAP2极显著上调约5倍(P<0.01);与脂肪酸吸收水解相关的LPL轻微上调,与脂解相关的HSL变化不显著而ATGL极显著上调约3倍(P<0.01)(与对照组相比)。(4)构建FGF9腺病毒超表达载体,超表达效率约为2749倍(P<0.01)。超表达FGF9后,肌内脂肪细胞中脂滴的积聚减少,甘油三酯含量显著降低(P<0.05)。超表达FGF9使脂肪细胞分化标志基因C/EBPα、C/EBPβ、SREBP1下调,PPARγ的表达显著下调(P<0.05),而分化抑制基因Pref1则显著上调(P<0.05);同时,与脂肪酸从头合成相关的ACACA极显著上调4倍(P<0.01),而FASN没有显著变化,与脂肪酸转运相关的FABP3略微下调,与甘油三酯合成相关的DGAT1没有显著变化,而GAP2显著下调(P<0.05),与脂肪酸吸收水解相关的LPL没有显著变化,与脂解相关的HSL、ATGL则分别极显著上调约2.5倍(P<0.01)和2倍(P<0.01)(与对照组相比)。(5)受体FGFRs基因在山羊肌内脂肪细胞分化过程中的表达模式显示,FGFR1、FGFR3和FGFR4表达变化相似,都出现较为明显的下降趋势。而只有FGFR2从肌内前体脂肪细胞开始分化便呈现缓慢升高的趋势,到分化第6 d时表达量极显著增加到最高水平(P<0.01),这与FGF9在脂肪细胞分化中的表达模式相似。(6)干扰FGF9后,FGFR2和FGFR3两个受体基因表达水平下调,并且FGFR2达到极显著水平(P<0.01)。用si RNA分别干扰FGFR1-4在山羊肌内脂肪细胞中的表达,发现只有干扰FGFR2后,PPARγ和C/EBPβ表达水平极显著升高(P<0.01),C/EBPα和SREBP1升高不显著,Pref1表达下降(与对照组相比),这与干扰FGF9后的脂肪分化标志基因的表达变化一致。(7)共转染FGF9腺病毒超表达载体和不同浓度(0.08、0.10、0.12、0.14、0.16μmol/L)FGFR2-si RNA的山羊肌内前体脂肪细胞,其脂滴的聚集随干扰si RNA浓度的增加呈现出显著降低又略微回升的变化,脂肪分化标志基因PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ也表现出下降又上升的趋势,SREBP1则出现下降趋势,而Pref1随干扰浓度增加一直保持较高表达(与仅感染FGF9腺病毒组相比)。以上结果表明FGF9与FGFR2相互作用,通过调控PPARγ和Pref1表达来抑制山羊肌内脂肪细胞分化。这为后续研究FGF9调控山羊肌内脂肪细胞分化的信号通路机制提供了必要的数据支持。