论文部分内容阅读
目的:上皮细胞黏附分子(Epithelial Cellular Adhesion Molecule,Ep CAM)的分子大小约为40 k Da,具有I型跨膜蛋白的结构,是肿瘤干细胞的表面标志物之一。本论文应用噬菌体展示技术筛选了抗人Ep CAM的单域抗体(VH),并且进行了初步鉴定,后续的工作将进一步研究这些抗体在体内外的抗癌活性,为这些抗体将来用于治疗人的各种癌症奠定基础。方法:(1)采用噬菌体展示的人单域抗体文库,以Ep CAM基因第2个外显子编码的蛋白做为抗原筛选抗Ep CAM的单域抗体。(2)采用1个无关抗原作为对照,以制备的单克隆噬菌体抗体为一抗,采用ELISA方法初步鉴定可能的阳性抗体克隆。(3)采用另外6个无关抗原作为对照,采用ELISA方法进一步验证可能的阳性抗体克隆。(4)将抗体克隆进行DNA测序,比较不同的抗体DNA序列之间的关系。(5)采用ELISA的方法,检测经测序的单域抗体与购买的Ep CAM的完整胞外段的结合。结果:(1)采用人单域抗体文库,以Ep CAM为抗原,经过6轮文库筛选后,进行多克隆噬菌体ELISA检测,结果显示经过6轮筛选后,阳性噬菌体富集程度明显地升高。(2)单克隆噬菌体ELISA初步鉴定后得到17个可能的阳性克隆。(3)将这17个抗体克隆进行DNA测序,其中有3个克隆测序失败,其他14个克隆测序结果显示:a EP5、a EP9、a EP25、a EP86和a EP127的DNA序列相同,为同一抗体;a EP140、a EP203和a EP211的序列相同,为同一个抗体;其他6个抗体克隆的DNA序列均不同,为不同的抗体。所以,最终得到了8个不同的抗体。(4)采用ELISA方法检测这8个抗体与购买的Ep CAM的完整胞外段的结合能力。结果表明:aEP1、a EP149、a EP198和a EP269与Ep CAM的完整胞外段具有较强的结合能力,这4个抗体将用于后续抗癌实验研究,另外有3个抗体与Ep CAM的完整胞外段有较弱的结合,还有1个抗体与Ep CAM的完整胞外段不能结合。结论:应用噬菌体展示技术筛选单域抗体文库,得到抗人Ep CAM胞外段的4个单域抗体(aEP1、a EP149、a EP198和a EP269),这4个抗体与Ep CAM蛋白的结合有较强的特异性和较高的亲合力,本研究为下一步将这些抗体用于体内外抗癌作用的研究奠定了基础。