【摘 要】
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研究背景:支气管哮喘（简称哮喘）是常见的慢性呼吸道疾病,主要发病机制包括气道炎症、气道重塑和气道高反应性,其中气道血管生成和血管重塑是气道重塑的重要特征之一。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）可以调节血管平滑肌细胞和内皮细胞功能,在血管相关疾病的发生发展中起作用,特别是Ⅰ类HDACs成员--HDAC8已被认为是一种新的平滑肌细胞分化标记物。血管功能的表观遗传学调控机制除组蛋白乙酰化修饰外,还包括了非编
【基金项目】
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国家自然基金“特异性组蛋白去乙酰化酶6抑制剂通过调控HSP90乙酰化修饰治疗哮喘的机制研究”（81770021）； 辽宁省科学技术基金面上项目“HDAC8对支气管哮喘气道血管再生与重塑的调控作用及机制”（20170540994）；
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研究背景:支气管哮喘（简称哮喘）是常见的慢性呼吸道疾病,主要发病机制包括气道炎症、气道重塑和气道高反应性,其中气道血管生成和血管重塑是气道重塑的重要特征之一。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）可以调节血管平滑肌细胞和内皮细胞功能,在血管相关疾病的发生发展中起作用,特别是Ⅰ类HDACs成员--HDAC8已被认为是一种新的平滑肌细胞分化标记物。血管功能的表观遗传学调控机制除组蛋白乙酰化修饰外,还包括了非编码RNA。miR-381作为一种小分子非编码RNA,课题组前期研究发现miR-381-3p通过靶向调控TGF-β3的表达,参与HDAC8特异性抑制剂调控气道重塑的过程。研究目的:探讨HDAC8特异性抑制剂PCI-34051对哮喘小鼠肺组织中气道血管生成与重塑的作用,并探讨miR-381-3p在PCI-34051治疗哮喘小鼠气道血管改变中的作用及可能机制。研究方法:第一部分:特异性HDAC8抑制剂PCI-34051对哮喘小鼠肺组织中气道血管生成与重塑的影响。将BALB/C小鼠随机分作正常对照组、单纯哮喘组、地塞米松组和PCI-34051组,每组6只。应用卵白蛋白致敏和激发方法构建哮喘小鼠模型。采用小动物无创肺功能检测系统测定各组小鼠在乙酰甲胆碱激发下的气道阻力,HE染色观察气道炎症浸润水平,Masson染色观察气道壁周围胶原沉积水平,AB-PAS染色观察气道杯状细胞增生水平,Western Blot检测肺组织中HDAC8表达水平。Luminex多因子免疫检测比较各组小鼠血清中血管生成相关细胞因子IL17/IL17A,IL17E/IL25,IL6,IL13,TNF-α表达。免疫荧光双重染色观察α-SMA/CD31在肺组织中的表达分布并计算血管壁厚度、新生血管密度及血管内皮细胞数目,Western Blot检测肺组织中α-SMA的表达。免疫组织化学染色观察VEGF-A在肺组织中的表达分布,Western blot和QRT-PCR检测肺组织中VEGF-A、VEGFR2表达水平。第二部分:miR-381-3p在PCI-34051调控哮喘小鼠肺组织中气道血管改变的作用及可能机制研究。QRT-PCR检测哮喘小鼠肺组织中miR-381-3p表达情况。Western Blot法检测各组小鼠肺组织内TGF-β3、CD105、p-ERK1/2、PI3K p85、p AKT1、PDK1蛋白表达水平。免疫组织化学染色法检测肺组织内TGF-β3、CD105、p-ERK1/2、p AKT1表达分布。研究结果:第一部分:特异性HDAC8抑制剂PCI-34051对哮喘小鼠肺组织中气道血管生成与重塑的影响。1.哮喘组小鼠气道阻力升高,出现明显的气道高反应,气道血管周围可见大量炎症细胞浸润、气道壁增厚、上皮下大量胶原沉积、杯状细胞增生,HDAC8在肺组织内高表达,与哮喘组比,地塞米松和PCI-34051组上述表现减轻,表明哮喘小鼠模型构建成功。2.Luminex多因子免疫检测结果显示,哮喘组小鼠血清中血管生成相关细胞因子IL17/IL17A,IL17E/IL25,IL6,IL13,TNF-α表达显著增高,而地塞米松和PCI-34051干预后,各细胞因子显著减少,特别是PCI-34051的抑制效果更加。3.免疫荧光染色显示与哮喘组相比,应用PCI-34051干预后α-SMA、CD31表达下降,血管壁厚度降低,血管内皮细胞减少,气道旁新生血管减少。Western Blot结果也提示α-SMA在PCI-34051治疗后表达下降。4.免疫组化结果显示,与正常对照组相比,哮喘组小鼠气道血管周围见大量VEGFA表达,地塞米松和PCI-34051组VEGFA阳性表达显著减少。Western blot和QRT-PCR结果显示,PCI-34051显著降低哮喘小鼠肺组织VEGFA及VEGFR2的高表达。第二部分:miR-381-3p在PCI-34051调控哮喘小鼠肺组织中气道血管改变的作用及可能机制研究。1.QRT-PCR结果表明,哮喘小鼠肺组织内miR-381-3p表达明显减少,PCI-34051可显著逆转这种改变,甚至增加其表达。2.Western Blot和免疫组化结果表明,PCI-34051抑制哮喘小鼠肺组织TGF-β3和CD105的表达水平。3.免疫组化结果表明,哮喘组小鼠于气道血管周围可见p-ERK1/2,p AKT1阳性表达增强,PCI-34051组较哮喘组表达显著减少。4.Western Blot结果表明,PCI-34051降低哮喘小鼠肺组织p-ERK1/2,p AKT1,PI3K,PDK1的表达。研究结论:1.HDAC8特异性抑制剂PCI-34051可抑制OVA诱导的哮喘小鼠气道血管改变,其作用与下调VEGFA/VEGFR2信号通路有关。2.HDAC8特异性抑制剂PCI-34051通过上调miR-381-3p并抑制TGFβ3介导的ERK与PI3K/AKT信号通路调控哮喘小鼠气道血管生成。
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