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目的:CD8+T细胞在抗病毒免疫中发挥重要作用。在人类免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virustype 1,HIV-1）感染期间,由于抗原负荷升高,机体处于持续的免疫激活与高炎症反应中,使CD8+T细胞在内的免疫细胞过度活化与耗竭,功能受到损伤,即使经过抗逆转录病毒治疗（antiretroviraltherapy,ART）也不能完全恢复。这使机体抗病毒反应与免疫稳态进一步恶化,艾滋病相关与非艾滋病相关综合征的易感性增加。改善CD8+T细胞功能,对提高HIV-1感染者的预后有重要帮助。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是一种安全性高、免疫调控功能强大的多能干细胞,现已被应用于治疗移植物抗宿主病、重症新型冠状肺炎等免疫性疾病的的临床试验中,在缓解炎症因子风暴方面效果显著。脂肪来源间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs）取材方便、免疫原性低,是理想的MSCs来源。以往研究提示MSCs对CD8+T细胞有免疫调控作用,但MSCs对未治疗的与接受ART的HIV-1感染者CD8+T细胞功能是否有影响,国内外鲜有报道。本研究拟以HIV-1感染者为研究对象,开展体外细胞共培养实验,明确ADSCs对HIV-1感染者外周血CD8+T细胞的免疫调节作用,为艾滋病寻找新型有效的免疫辅助治疗策略。研究方法:1.研究对象:选取中国医科大学附属第一医院“红丝带”门诊的HIV-1感染者共35 例:其中未治疗 HIV-1 阳性患者（HIV-1+viremic untreated patients,VU）10 例;接受治疗的HIV-1感染者25例,包括免疫应答者（immune responders,IR）13例,免疫无应答者（immune non-responders,INR）12例。HIV-1阴性的健康人对照（healthy control,HC）11例,均为中国医科大学附属第一医院艾滋病研究所招募的健康志愿者。2.ADSCs细胞的培养与表面标志物检测本研究所用ADSCs为前期实验室提取的ADSCs,将其传代到P3-P7用于后续实验。将ADSCs浓度调整为1 × 106/ml,加入流式抗体,避光静置20min后,洗两遍细胞,补加300μl PBS,30分钟内上机检测。涉及到的流式抗体有:CD90-FITC、CD73-APC、CD105-PerCP、CD29-APC、CD44-PE、CD45-PerCP、PD-L1-PE。3.密度梯度离心提取外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）使用淋巴细胞分离液提取HIV-1感染者与健康对照外周血中的PBMCs。4.CD8+T细胞的负选与纯度测定使用 EasySepTM Human CD8+T Cell Isolation Kit 试剂盒负选 PBMCs 中的 CD8+T细胞,流式检测其纯度。5.CD8+T细胞与ADSCs共培养体系的建立ADSCs铺到24孔板中并用IFN-γ预刺激48h。按照共培养分组在贴壁的ADSCs上加入刺激或者未刺激的CD8+T细胞,放入培养箱。6.T细胞活化、分化及免疫检查点表面标志物检测CD8+T 细胞用 CD3/CD28 dynabeads 预刺激 24h 后,与 ADSCs 共培养 72h。共培养结束用相应的流式抗体进行表面染色后,加入7-AAD死活染料,上机检测。涉及到的流式抗体有:HLA-DR-BV411、CD38-BV711、CD25-PE/Cy7、CD69-PE、CD45RA-BV510、CCR7-FITC、PD-1-PE。7.T细胞分泌IFN-γ及脱颗粒功能检测以CD3/CD28 dynabeads刺激CD8+T细胞,同时加入流式抗体CD107a-PE 5μl/孔,CD8+T细胞与ADSCs共培养24h。共培养结束前6h加入Golgi-Stop,结束后染LIVE/DEAD,破膜染IFN-γ-APC,上机检测。8.T细胞增殖能力检测CD8+T细胞使用CellTrace Violet示踪染料（1μl/ml）染色后,加入CD3/CD28 dynabeads,与ADSCs共培养96h后上机检测。9.统计学分析通过Flowjo V10软件对流式结果进行画门及分析。采用GraphPad Prism 8.0.2软件对实验数据进行分析与绘图。不符合正态分布的数据多组比较采用Kruskal-Wallis检验与Dunnett’s多重比较检验,两组比较用Mann-Whitney检验,同一样本经过不同处理后的结果比较采用Wilcoxon检验,当p＜0.05时认为差异有统计学意义。结果:1.ADSCs的表面标志物鉴定符合MSCs表面标志物特征。2.ADSCs对HIV-1感染者外周血CD8+T细胞活化水平的影响CD8+T细胞与ADSCs共培养后,ADSCs使IR组与HC组CD8+T细胞CD25水平显著下调（IR:p=0.0273,HC:p=0.0312）;VU 组、IR 组与 HC 组 CD8+T 细胞 CD69 表达显著上调（VU:p=0.0391,IR:p=0.0273,HC:p=0.0312）;HC、IR和 INR 组 HLA-DR 表达显著上调（HC:p=0.0137,IR:p=0.0081,INR:p=0.0005）。HC、VU、IR、INR 四组 CD38 表达均显著上调（HC:p=0.0020,VU:p=0.0098,IR:p=0.0002,INR:p=0.0005）;HLA-DR+CD38+双阳表达在 HC、VU、IR、INR四组均显著上调（HC:p=0.0049,VU:p=0.0273,IR:p=0.0002,INR:p=0.0005）。3.ADSCs对HIV-1感染者外周血CD8+T细胞不同分化亚群活化水平的影响HC、VU、IR和INR四组人群CD8+T细胞在与/未与ADSCs共培养后的分化情况无明显区别。分析ADSCs对四组人群CD8+T细胞不同分化亚群上HLA-DR、CD38以及HLA-DR+CD38+的表达水平的影响,在HC组中,ADSCs主要上调Na（?）ve、CM、EM、EMRA四个分化亚群的CD38表达与效应亚群EM和EMRA的HLA-DR表达和HLA-DR+CD38+百分比。在IR与INR组中,ADSCs主要上调CD8+T细胞的效应亚群EM和EMRA中的CD38表达及HLA-DR+CD38+百分比。4.ADSCs对HIV-1感染者外周血CD8+T细胞增殖水平的影响ADSCs抑制HC组人群CD8+T细胞增殖水平（p=0.0020）,对HIV-1感染组人群CD8+T细胞也有抑制的趋势（p=0.0649）。5.ADSCs对HIV-1感染者外周血CD8+T细胞免疫检查点PD-1的影响ADSCs使HC、VU、IR、INR四组人群CD8+T细胞的PD-1表达均显著上调（HC:p=0.0537,VU:p=0.0273,IR:p=0.0024,INR:p=0.0020）。其中,ADSCs显著上调HC组的Na（?）ve亚群（p=0.0312）、IR组的CM亚群（p=0.0371）、INR组的 Na（?）ve 亚群（p=0.0312）的 PD-1 表达。6.ADSCs对HIV-1感染者外周血CD8+T细胞分泌IFN-γ水平与脱颗粒功能的影响ADSCs显著下调HC、VU、IR及INR组CD8+T细胞的CD107a水平（HC:p=0.0020,VU:p=0.0020,IR:p=0.0234,INR:p=0.0020）和 HC、IR、INR 三组的胞内 IFN-γ 水平（HC:p=0.0156,IR:p=0.0078,INR:p=0.0371）。ADSCs 表面高表达PD-L1。结论:首次应用ADSCs与HIV-1感染者外周血CD8+T细胞共培养体系,发现ADSCs促进HLA-DR、CD38、HLA-DR+CD38+和CD69的表达,降低CD25表达,提示ADSCs对HIV-1感染者CD8+T细胞的活化水平有调节作用;ADSCs促进HIV-1感染者外周血CD8+T细胞免疫检查点分子PD-1表达;ADSCs降低脱颗粒功能及分泌IFN-y水平,提示ADSCs对HIV-1感染者外周血CD8+T细胞的杀伤效应功能有抑制作用。本研究为ADSCs对HIV-1感染者外周血CD8+T细胞的免疫调节作用提供了重要体外实验数据支撑。