研究背景和目的牙髓牙本质作为一个复合体,具有一定的修复再生能力,当牙髓受到感染、外伤、物理和化学等刺激时,牙髓组织中所含有的牙髓干细胞可增殖、迁移到受损部位,并分化为成牙本质细胞样细胞,形成修复性牙本质,保护牙髓免受进一步的伤害。而当刺激超过牙髓防御反应所能承受的阈值时,可进一步发展为牙髓炎或根尖周炎。以控制感染、促进根尖周病愈合为主要目的根管治疗术是目前的主要治疗方法,但是其并不能恢复牙髓牙本质复合体的活性和功能,而随着对牙髓生物学研究的不断深入,再生性牙髓治疗(regenerative endodontics)逐渐受到学者们的关注,其中当前研究较多并运用于临床的是牙髓血运重建(revascularization),但是其并非真正意义上的牙髓牙本质复合体的再生,因为在组织学上观察发现形成的组织具有牙周来源性质,并且无以成牙本质细胞样细胞覆盖于牙本质样结构表面为特征的牙髓样组织的形成。牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)是从牙髓组织中分离出来的具有自我更新和多向分化潜能的间充质干细胞,无论是在牙髓组织损伤修复,还是在牙髓再生过程中,DPSCs的成牙本质向分化都是关键环节之一,其受到复杂信号分子通路的调控,但是其中的机制至今仍未阐明。由细胞黏附分子介导的细胞.细胞间和细胞.基质间的相互作用是调节细胞功能的重要机制,前者主要由钙黏蛋白(cadherins)所介导,而后者则主要由整合素(integrins)介导。钙黏蛋白是一类介导钙依赖型细胞间黏附的黏附分子超家族,包括经典钙黏蛋白、桥粒钙黏蛋白、原钙黏蛋白、七次跨膜钙黏蛋白和FAT样钙黏蛋白等。其中N-cadherin属于经典钙黏蛋白家族中的一员。N-cadherin不仅参与介导细胞间黏附,还可涉及多种信号通路,参与细胞增殖、凋亡、迁移和分化等生理过程。目前对N-cadherin的研究主要集中在介导肿瘤细胞侵袭转移和成骨细胞的分化方面。研究报道,N-cadherin可与成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor, FGFR)相互作用,减少配体介导的FGFR下调,持续激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)／细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)信号通路,引起基质金属蛋白酶.9(matrix metalloprotein-9, MMP-9)转录增加,继而介导肿瘤细胞侵袭转移。而在成骨细胞方面,N-cadherin可直接与Wnt共受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6 (low density lipoprotein receptor-related protein 5/6, LRP5/LRP6)相互作用,抑制Wnt/β-catenin信号通路,从而抑制成骨细胞分化和减少骨形成。N-cadherin在牙齿发育和牙髓组织损伤修复中的作用亦有报道,研究显示N-cadherin在人牙齿发育过程中表达于正在分化和功能性的成牙本质细胞,并且N-cadherin高表达于龋损或损伤周围形成修复性牙本质的成牙本质细胞。以上结果提示,N-cadherin可能在牙齿发育和牙髓组织损伤修复过程中发挥着重要作用。然而,牙髓细胞中是否有N-cadherin的表达尚存在争议,并且N-cadherin对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)生理功能的影响尚不明确。因此,本课题旨在明确N-cadherin在hDPSCs中的表达和定位,研究N-cadherin对hDPSCs增殖、迁移以及成牙本质向分化的作用,阐明N-cadherin在牙髓组织损伤修复中的作用,同时为牙髓再生提供理论依据。方 法1. N-cadherin在人牙髓干细胞中的表达收集13-25岁志愿者因正畸或阻生需要而拔除的新鲜无龋损、无牙周病的健康前磨牙或第三磨牙,采用组织块酶消化法体外分离培养hDPSCs;取生长状态良好的hDPSCs,制作细胞爬片,采用免疫细胞化学检测波形丝蛋白和角蛋白的表达,进行细胞来源鉴定；胰酶消化收集生长状态良好的hDPSCs,流式细胞术检测细胞表面标志物；采用含有100 nM地塞米松、50 mg/L抗坏血酸、10 mM β-甘油磷酸钠的成牙本质诱导培养基对hDPSCs进行牙本质向分化诱导14 d后,茜素红染色检测矿化结节形成能力；采用含有1μM地塞米松、200μM吲哚美辛、0.5 mM 3-异丁基-1甲基黄嘌呤(IBMX)、10μg/mL胰岛素的成脂诱导培养基对hDPSCs进行成脂向分化诱导21d后,油红O染色检测脂滴形成情况。TRIzol法提取hDPSCs,总RNA,逆转录聚合酶链式反应(Reverse-transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)检测hDPSCs中N-cadherin mRNA的表达情况；取生长状态良好的hDPSCs,制作细胞爬片,免疫细胞化学检测N-cadherin在hDPSCs中的表达和定位；对hDPSCs进行成牙本质向分化诱导7 d和14 d,分别提取诱导组和对照组总RNA,实时定量聚合酶链式反应(Real time quantitative polymerase chain reaction, Real time PCR)检测hDPSCs成牙本质向分化诱导后N-cadherin表达量的变化。2.抑制N-cadherin表达对人牙髓干细胞成牙本质向分化的影响制备N-cadherin shRNA’慢病毒；根据完全培养基(complete medium, CM)(含100mL/L FBS的DMEM)、感染增强液(enhanced infection solution, Enis)、 MOI(10、25、50)、polybrene(5 μg/mL)的不同分为12组,摸索N-cadherin ShRNA慢病毒转染hDPSCs的最佳条件；根据最佳转染条件对P3 hDPSCs进行病毒转染,72 h后倒置荧光显微镜下观察转染效率,并分别提取各组hDPSCs总RNA和总蛋白,Real time PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平验证抑制N-cadherin表达的效率,构建N-cadherin表达抑制hDPSCs模型。对WT组、ShRNA-Ctrl组和ShRNA-N-cad组hDPSCs进行成牙本质向分化诱导后,采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色检测ALP活性,茜素红染色检测矿化结节形成能力；此外,采用Real time PCR和Western blot检测成牙本质相关基因ALP、骨钙素(osteocalcin, OCN)、牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1, DMP1)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein, DSPP)的表达和可能信号分子β-catenin的表达,研究抑制N-cadherin表达对hDPSCs成牙本质向分化的影响。3.抑制N-cadherin表达对人牙髓干细胞增殖和迁移的影响将生长状态良好的P3 WT组、ShRNA-Ctrl组与ShRNA-N-cad组hDPSCs接种于96孔板,CCK-8法检测第1.8 d相同时间点450 nm波长处光密度值(optical density, OD),绘制细胞生长曲线：胰酶消化收集各组hDPSCs,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,研究N-cadherin表达抑制后hDPSCs的增殖情况。分别将5x104个WT组、ShRNA-Ctrl组和ShRNA-N-cad组hDPSCs接种于Transwell小室的上室,其中上室加入无血清培养基200 I.tL,下室加入完全培养基600 μL,20 h后观察并分析穿过小孔的细胞数量,检测N-cadherin表达抑制对hDPSCs迁移能力的影响；同时采用Real time PCR检测各组hDPSCs趋化因子基质细胞衍生因子.1(stromal cell-derived factor-1, SDF-1)和CXC趋化因子受体4(CXC receptor 4, CXCR4)的表达情况。结 果1.人牙髓干细胞的培养和鉴定实验所分离培养的细胞生长状态良好,呈成纤维细胞样。免疫细胞化学结果显示波形丝蛋白表达阳性,角蛋白表达阴性,流式细胞术结果显示间充质干细胞表面标志物CD44、CD90、CD29阳性表达率分别为100%、99.9%、94.7%,造血细胞表面标志物CD45、CD31、CD34阳性表达率为分别0.47%、0.13%、0.16%。成牙本质向分化诱导14 d后,茜素红染色显示有大量大小不等的红褐色矿化结节形成：成脂向分化诱导21 d后,油红O染色显示细胞胞浆内有橘红色脂滴形成。2. N-cadherin在人牙髓干细胞中的表达RT-PCR结果显示hDPSCs中有N-cadherin mRNA的表达,免疫细胞化学结果显示,N-cadherin在hDPSCs的表达主要定位于细胞膜和细胞质。hDPSCs成牙本质向分化诱导7 d和14 d后,诱导组N-cadherin的表达与对照组相比均显著下调。3. N-cadherin表达抑制人牙髓干细胞模型的构建成功制备N-cadherin ShRNA慢病毒,转染hDPSCs的最佳条件为完全培养基、polybrene 5μg/mL、MOI=25。N-cadherin ShRNA慢病毒转染hDPSCs 72 h后,倒置荧光显微镜下观察细胞转染效率可达80%以上, Real time PCR和Western blot结果显示,hDPSCs中N-cadherin mRNA和蛋白水平的表达均受到显著抑制。4.抑制N-cadherin表达对人牙髓干细胞成牙本质向分化的影响成牙本质向分化诱导后,Real time PCR和Western blot结果显示,相对于ShRNA-Ctrl组,ShRNA-N-cad组成牙本质相关基因ALP、OCN、DMP1和DSPP的表达均显著上调,同时β-catenin表达亦明显增加,并且碱性磷酸酶活性和矿化结节形成数量亦显著提高。5.抑制N-cadherin表达对人牙髓干细胞增殖能力的影响CCK-8结果显示ShRNA-N-cad组与ShRNA-Ctrl组相比,细胞增殖活性以第5 d为转折点,呈先增高后降低的趋势。流式细胞术结果显示,在第6 d,与ShRNA-Ctrl组比较,ShRNA-N-cad组G0/G1期细胞比例显著增加,而S期和G2/M期细胞比例则明显减小,并且ShRNA-N-cad组凋亡细胞比例显著高于ShRNA-Ctrl组。6.抑制N-cadherin表达对人牙髓干细胞迁移能力的影响Transwell结果显示ShRNA-N-cad组穿过小孔的细胞数量显著多于ShRNA-Ctrl组。Real time PCR结果显示,与ShRNA-Ctrl组相比,ShRNA-N-cad组SDF.1和CXCR4的表达量均显著增加。结 论1.成功体外分离培养hDPSCs,其来源于间充质,具有成牙本质向分化和成脂向分化潜能。2. hDPSCs中有N-cadherin的表达,并且主要定位于细胞膜和细胞质。3.成功构建N-cadherin表达抑制hDPSCs模型。4.抑制N-cadherin表达可能通过激活β-catenin信号通路而促进hDPSCs成牙本质向分化。5.抑制N-cadherin表达可影响hDPSCs的增殖能力。6.抑制N-cadherin表达可能通过上调SDF-1/CXCR4的表达而促进hDPSCs的迁移能力。