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葡萄（Vitis）是世界上一种重要的经济果树,具有极高的营养价值。目前世界范围内广泛栽培的品种多为品质优良的欧洲葡萄,但其抗病性较差,易受到灰霉菌（Botrytis cinerea）的侵染。因此,挖掘葡萄抗灰霉病关键基因,了解其抗病功能及调控机理,对葡萄抗病分子育种具有重要的意义。乙烯响应转录因子（ERF）在植物的生长发育,应对生物及非生物胁迫过程中发挥重要作用。本研究依据葡萄基因组数据库,对葡萄ERF家族基因进行鉴定和表达分析,筛选灰霉菌诱导显著差异表达基因,明确其抗灰霉病功能。进一步利用酵母双杂交系统筛选抗灰霉病关键ERF基因的互作蛋白,并阐明其抗病功能。利用酵母单杂交和双荧光素酶报告基因试验验证二者在抗灰霉病过程中的协同作用,揭示抗灰霉病关键ERF基因的功能及调控机理。主要研究结果如下:1、葡萄抗灰霉病关键ERF基因的筛选。根据葡萄基因组数据库,鉴定得到113个葡萄ERF转录因子（Vv ERFs）并根据其染色体定位进行命名（Vv ERF001-Vv ERF113）。通过与拟南芥ERF家族基因的系统发育比较及多重序列比对,将葡萄ERF家族基因划分为11个亚家族（I,II,III,IV,V,VI,VII,VIII,IX,X和VI-L）。共线性分析和Ka/Ks比值计算表明,基因串联和并联重复事件的发生是葡萄ERF家族基因扩展的主要原因。通过内含子和外显子的结构特征,分析葡萄ERF家族基因之间的进化关系。表达分析发现,35个葡萄ERF基因在灰霉菌处理后出现差异表达。其中,Vv ERF16的表达在灰霉菌侵染葡萄叶片的关键时间点被显著诱导。以上结果表明Vv ERFs可能参与葡萄应对灰霉菌胁迫的响应过程。Vv ERF16基因可能在葡萄应对灰霉菌侵染过程中发挥关键作用。2、葡萄Va ERF16基因抗病功能研究。以高抗中国野生山葡萄‘双优’为材料,克隆得到Va ERF16基因并进行功能研究。结果表明,Va ERF16受JA/ET激素处理诱导表达且定位于植物细胞核中。异源过表达Va ERF16的拟南芥株系增强了对不同病原菌的抗性。接种灰霉菌（Botrytis cinerea）后,过表达株系的细胞死亡及过氧化氢的积累显著降低,参与活性氧合成的NADPH氧化酶基因At RBOHD及At RBOHF的表达被抑制。灰霉菌在转基因株系上的定殖量明显低于野生型,转基因株系中JA/ET信号途径防卫基因At PDF1.2、At LOX3和At PR4的转录水平明显高于野生型株系。接种丁香假单胞菌（Pst DC3000）后,与转基因株系相比,野生型株系叶片出现失绿、萎蔫和黄化等症状,单位叶面积的细菌数目（约为10~7 cfu/cm~2）显著高于过表达株系（约为10~4 cfu/cm~2）。同时,转基因株系中SA信号途径相关防卫基因At NPR1和At PR1的表达受到显著上调。利用农杆菌介导的葡萄叶片瞬时转化试验验证了Va ERF16基因在葡萄中的抗灰霉病功能。在感灰霉病葡萄材料‘红地球’和‘无核白’叶片中瞬时过表达Va ERF16并接种灰霉菌。台盼蓝染色发现,瞬时过表达Va ERF16叶片上的灰霉菌菌丝生长缓慢且数量较少。与野生型和瞬转空载体叶片相比,灰霉菌生物量明显降低,JA/ET信号通路关键防卫基因PDF1.2和ERF20的表达量显著提高。相反,在抗灰霉病葡萄材料‘双优’和‘巨玫瑰’叶片中瞬时沉默Va ERF16则降低了对灰霉病的抗性,灰霉菌的定殖量较野生型叶片明显提高,JA/ET信号通路关键防卫基因PDF1.2和ERF20的转录水平显著降低。上述结果表明Va ERF16基因通过不同的激素信号途径调控拟南芥对病原菌的抗性,并且在葡萄中同样具有抗灰霉病功能。3、葡萄Va ERF16互作蛋白的筛选。以Va ERF16无自激活活性的片段为诱饵蛋白,从灰霉菌接种处理的中国野生山葡萄‘双优’酵母c DNA文库中筛选到Va ERF16的互作蛋白Va MYB306。通过酵母双杂交回复验证、双分子荧光互补（Bi FC）、免疫共沉淀（Co-IP）和Split-LUC实验证明Va ERF16和Va MYB306在植物体内体外均存在互作关系。对Va MYB306基因进一步分析表明,Va MYB306属于R2R3-MYB转录因子家族,定位于植物细胞核且受到灰霉菌及JA/ET激素处理诱导表达。上述结果表明Va MYB306基因可能参与葡萄应对灰霉菌胁迫的免疫反应。4、葡萄Va MYB306基因抗灰霉病功能研究。瞬时过表达Va MYB306基因的‘红地球’和‘无核白’叶片提高了对灰霉病的抗性,与野生型和瞬转空载体叶片相比,灰霉菌菌丝生长缓慢且数量较少,灰霉菌生物量明显降低,JA/ET信号通路关键防卫基因的表达量明显提高。相反,瞬时沉默Va MYB306基因的‘双优’和‘巨玫瑰’叶片则降低了对灰霉病的抗性,灰霉菌的生物量较野生型叶片明显提高,JA/ET信号通路关键防卫基因PDF1.2和ERF20的转录水平显著降低。上述结果表明Va MYB306基因在葡萄中具备抗灰霉病功能且通过JA/ET信号途径调控葡萄对灰霉病的抗性。5、葡萄Va ERF16基因抗灰霉病调控机理研究。酵母单杂交和双荧光素酶报告基因试验表明,Va ERF16能直接结合Va PDF1.2的启动子并正向调控其表达。Va MYB306则无法直接结合Va PDF1.2的启动子,而是通过与Va ERF16互作,间接提高Va PDF1.2的转录水平。以上结果表明Va ERF16和Va MYB306基因在葡萄抗灰霉病过程中起到协同作用并通过调控防卫基因的表达提高葡萄对灰霉病的抗性。综上所述,中国野生山葡萄Va ERF16基因通过提高JA/ET信号途径相关防卫基因的转录水平,增强了对灰霉菌的抗性;Va MYB306通过与Va ERF16互作,调控Va PDF1.2的表达,提高葡萄对灰霉病的抗性。本研究明确了ERF转录因子参与的葡萄抗灰霉病调控网络,为葡萄抗病分子育种提供了理论依据。