【摘 要】
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固醇是昆虫重要的营养物质,在其体内行使重要的生理功能。昆虫是固醇异养型生物,因此,植食性昆虫必须从植物中获取固醇营养。食物中的固醇营养进入昆虫肠道细胞内主要通过吸收途径的两个关键蛋白NPC1b（Nieman pick type C1b）和SCP-2（Sterol carrier protein 2/x）蛋白介导的转运机制。前期的研究表明昆虫的NPC1b和SCP-2蛋白对不同固醇的结合不存在选择性,
【基金项目】
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国家自然科学基金（编号:31672369,31872299）； 西北农林科技大学人才引进启动基金；
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固醇是昆虫重要的营养物质,在其体内行使重要的生理功能。昆虫是固醇异养型生物,因此,植食性昆虫必须从植物中获取固醇营养。食物中的固醇营养进入昆虫肠道细胞内主要通过吸收途径的两个关键蛋白NPC1b（Nieman pick type C1b）和SCP-2（Sterol carrier protein 2/x）蛋白介导的转运机制。前期的研究表明昆虫的NPC1b和SCP-2蛋白对不同固醇的结合不存在选择性,而昆虫对植物固醇的吸收效率却不同,因此推测昆虫体内存在着某种选择调控机制,能够调节不同固醇的吸收和转运。其中,哺乳动物体内ABC转运蛋白介导的固醇特异性排出机制,可能在昆虫中存在并介导了固醇的吸收调控。进入昆虫体内的固醇还可以转化成固醇酯而储存在细胞中。因此,固醇的吸收、特异性排出和储存的相互协调让昆虫体内的固醇维持在动态平衡的状态。此外,有研究表明许多细菌可以代谢利用固醇营养。许多昆虫的肠道中驻存有大量的细菌,因此,昆虫肠道细菌可能会代谢食物中的固醇从而与昆虫竞争固醇营养。目前,关于昆虫固醇营养的吸收调控、储存以及肠道细菌对食物中固醇营养的影响这三方面的研究仍然较少。本研究以重要农业害虫棉铃虫（Helicoverpa armigera）为实验材料,对可能参与代谢和调控其肠道内固醇营养的相关因子进行筛选,并进行功能分析与验证。主要研究结果如下:1、棉铃虫肠道中参与固醇选择性排出的ABC转运蛋白基因的筛选与功能验证。使用胆固醇和胆甾烷醇饲喂棉铃虫,转录组测序进行基因筛选,获得肠道高表达并可能参与选择性排出胆甾烷醇的ABC转运蛋白,主要是ABCA亚家族和ABCG亚家族的基因。通过CRISPR/Cas9技术初步筛选出Ha OG200342基因参与固醇的选择性排出;并通过品系纯化和ABC转运蛋白抑制剂饲喂实验在体内验证了该基因参与固醇的选择性排出;最后通过体外浸泡实验和蛋白模拟对接实验在体外验证了该基因能够特异性地排出胆甾烷醇。最终确定棉铃虫肠道高表达的ABC转运蛋白Ha OG200342基因参与了特异性排出胆甾烷醇的代谢途径。2、棉铃虫Ha OG200342纯合子转录组测序分析筛选新的固醇特异性排出调控基因。用胆固醇和胆甾烷醇饲料饲喂棉铃虫Ha OG200342纯合品系和野生品系,进行转录组测序。经过差异基因筛选、GO和KEGG显著性富集分析,最终筛选出7个可能参与调节棉铃虫肠道固醇特异性排出的相关基因并对其进行了初步功能注释。3、棉铃虫肠道中参与固醇存储的基因筛选与功能验证。通过系统发育树的构建筛选出可能参与棉铃虫固醇存储的两个MBOAT基因Harm.010114.1和Harm.001362.1,这两个基因分别对应哺乳动物的ACAT基因和DGAT1基因。通过CRISPR/Cas9技术确认了参与棉铃虫肠道固醇存储的关键基因是Harm.010114.1;并通过固醇代谢生化分析和蛋白模拟对接实验多方面验证,且发现Harm.010114.1对不同固醇的存储具有一定的选择性;进一步研究发现Harm.010114.1的表达受ABC转运蛋白Ha OG200342表达的影响。同时验证了Harm.001362.1不参于棉铃虫肠道内的固醇存储,而是参与棉铃虫肠道内甘油三酯的合成,该基因的缺失影响幼虫的生长发育,且显著影响雌成虫的卵巢发育,导致雌成虫产卵量和卵孵化率的显著下降。4、棉铃虫肠道中具有胆固醇氧化酶基因的细菌的筛选。通过对5个野生种群的棉铃虫肠道细菌进行16S r RNA测序,并对五个种群的棉铃虫肠道微生物进行物种群落和结构的分析,发现物种的种类与丰度与前人研究保持一致,不同种群的物种差异主要是由寄主引起;同时结合中性模型分析,筛选出能够在棉铃虫肠道中长期驻存的菌种,结合能够编码胆固醇氧化酶的菌种,初步筛选出7个可能在棉铃虫肠道内长期驻存的具有胆固醇氧化酶基因的菌种。综上所述,本研究分析确认了ABC转运蛋白Ha OG200342和MBOAT蛋白Harm.010114.1参与了棉铃虫肠道内不同固醇的选择性排出和存储,从而导致了昆虫对固醇吸收效率不同的现象,为完善昆虫固醇的代谢理论提供了重要依据。此外,本研究还筛选出可能参与棉铃虫肠道内固醇代谢与调控相关的靶标基因和肠道细菌,为下一步深入分析固醇营养的代谢机制提供重要线索。
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