本研究拟在HIRI大鼠模型预防性使用附子多糖，观察它对HIRI大鼠的肝脏保护作用，并探讨其机制。研究结果为进一步完善中草药多糖活性组分的药物应用价值开发，为中药复方药效物质基础和作用机理研究提供参考，为进一步开发新药和临床用药提供科学依据，同时也为HIRI防治提供新的有效药物。 第一部分：大鼠肝脏缺血再灌注损伤与细胞胀亡的关系 材料与方法： 1.肝缺血再灌注损伤模型的制作 16只SD大鼠随机分为两组：假手术组和模型组，每组8只。动物麻醉开腹后阻断供应大鼠肝左、中叶的门静脉和肝动脉分支60min，松夹恢复左、中肝灌流。120min后取颈动脉血10ml，检测血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶检测、胆碱脂酶和白蛋白。 2.检测指标 实验结束后，取肝脏组织块，行Hitachi透射电子显微镜观察。制作肝细胞悬液，Annexin V—FITC/PI免疫荧光染色后进行流式细胞仪检测。肝脏组织进行Caspase—3、TUNEL免疫荧光染色。 结果： 1.肝脏酶学检测结果 假手术组血浆肝脏酶AST、ALT、LDH、CHE水平分别为169.8 U/L、67.1 U/L、901.0 U/L、166.8U/L，模型组的分别为2178.4 U/L、1347.9 U/L、5148.0 U/L、448.6U/L。与假手术组比较，模型组大鼠肝脏酶AST、ALT、LDH、CHE均明显增高，两组比较差别有显著性。 2.电子显微镜检测结果 透射电子显微镜检测假手术组肝细胞正常，模型组可见较多数的胀亡细胞和凋亡细胞。 3.Annexin V—FITC/PI免疫荧光染色流式细胞仪检测肝脏细胞凋亡、胀亡结果 假手术组胀亡细胞和凋亡细胞百分比分别是0.15％和0.65％，模型组的百分比均升高，为24.55％和14.99％。而模型组正常细胞的百分比较假手术组的下降。 4.Caspase—3、TUNEL免疫荧光染色及HE染色检测结果 假手术组Caspase—3(+)百分比为1.74％、TUNEL(+)细胞百分比为2.37％，胀亡细胞的百分比0.59％，模型组的分别为16.36％、20.26％和16.27％，两组间比较差别有显著性(P<0.05)。与各组相应的Caspase—3(+)细胞比较，TUNEL(+)细胞的百分比明显较高，两者比较差别有显著性。说明TUNEL(+)细胞的百分比远高于Caspase—3(+)细胞的百分比。 从组织切片上可以看到，一部分TUNEL(+)细胞Caspase—3染色为阴性，对应的HE片子上显示此细胞为胀亡细胞。 结论： 1.肝脏细胞胀亡是HIRI重要的细胞死亡方式。 2.在HIRI中如果以TUNEL法作为评价细胞凋亡的指标，则导致过度评价。 第二部分附子多糖保护HIRI大鼠肝脏的量效、时效关系研究 材料与方法： 1.动物分组 1.1附子多糖抗大鼠HIRI作用的量效关系研究实验 1.2.附子多糖抗大鼠HIRI作用的时效关系研究实验 1.3方法 动物模型的制作及假手术组处理如第一部分所述，各组SD大鼠肝缺血再灌注损伤模型的制作后，检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)检测、胆碱脂酶(CHE)和白蛋白(ALB)。放血处死动物，开腹取肝脏组织，行HE染色观察组织标本肝组织损伤程度评分。 结果： 1.附子多糖抗大鼠肝脏缺血再灌注损伤作用的量效关系比较 1.1肝功能变化结果比较 1.2肝脏贮备功能变化比较 1.3肝组织损伤程度病理评分比较 2.附子多糖抗大鼠肝脏缺血再灌注损伤作用的时效关系比较 2.1肝功能结果比较 2.2肝脏贮备功能变化比较 2.3肝组织损伤程度病理评分比较 结论： 1.附子多糖在不同剂量(80mg/kg、160mg/kg、320mg/kg连续5天灌胃)、不同使用时间(160mg/kg连续3天、5天、7天灌胃)上对肝脏缺血再灌注损伤均有相应程度的保护作用。 2.连续5天以160mg/kg剂量的附子多糖灌胃用以保护HIRI有最佳的时间和剂量效应。 第三部分附子多糖抗大鼠肝脏缺血再灌注损伤的机制研究 材料与方法： 1.动物分组及实验过程 实验分为三组：假手术组，模型组，模型+FPS组(160mg/kg，5d)。模型的复制和药物的使用同第一部分及第二部分。实验具体操作方法同第一部分及第二部分。 2.氧化应激指标检测 实验结束时留取肝脏组织，测定组织中的SOD活性，MDA含量，总抗氧化能力(T—AOC)，CAT活性，GR活性； 3.线粒体指标检测 取肝脏组织进行电子显微镜检测并进行线粒体体视学测量。取肝脏组织检测线粒体呼吸控制率、Na+—K+—ATP酶活性、Ca2+—ATP酶活性。 4.肝脏细胞凋亡、胀亡检测 同第一部分。 结果： 1.氧化应激指标检测结果 与假手术组(27.13U/gprot)比较，模型组(45.68U/gprot)和模型+FPS组(37.72U/gprot)的MDA均升高，但模型+FPS组升高幅度较模型组的低，三组间比较差别有显著性(P<0.05)。与假手术组(SOD、CAT、GR、T—AOC值分别为151.34 U/gprot、76.47 U/gprot、7.42 U/gprot、1.34 U/gprot)比较，模型组(SOD、CAT、GR、T—AOC值分别为80.74 U/gprot、47.82U/gprot、6.45 U/gprot、0.56 U/gprot)和模型+FPS组(SOD、CAT、GR、T—AOC值分别为134.17 U/gprot、55.55 U/gprot、6.82U/gprot、1.06 U/gprot)的SOD、CAT、GR、T—AOC值均降低，但模型+FPS组降低幅度较模型组的低，三组间比较差别有显著性(P<0.05)。说明附子多糖预防用药后，HIRI大鼠肝脏组织氧化性物质含量下降，还原性物质增多。 2.线粒体指标检测结果 与假手术组比较，模型组大鼠肝脏细胞线粒体的平均粒子数、平均周长、平均面积均较高(P<0.05)；与模型组大鼠肝脏细胞线粒体的平均粒子数、平均周长、平均面积比较，模型+FPS组的均较小(P<0.05)。三组大鼠肝脏细胞线粒体的面积密度、粒子数密度、比表面的比较情况同二维体视学参数(P<0.05)，体积密度三组间比较差别无显著性(P>0.05)。说明附子多糖预防用药后，HIRI大鼠线粒体肿胀程度下降，线粒体变形程度减轻。 模型组大鼠肝脏细胞线粒体的呼吸控制率、Na+—K+—ATP酶活性、Ca2+—ATP酶活性分别为3.01％、0.72μ molPi/mgprot/h、0.67μ molPi/mgprot/h明显较假手术组(0.79％、1.48μ molPi/mgprot/h、1.13μ molPi/mgprot/h)的降低，而模型+FPS组大鼠肝脏细胞线粒体的呼吸控制率、Na+—K+—ATP酶活性、Ca2+—ATP酶活性(5.31％、1.46μmolPi/mgprot/h、0.91μ molPi/mgprot/h)明显较模型组的增高，差别有显著性(P<0.05)。 3.流式细胞仪检测 假手术组凋亡细胞和胀亡细胞的百分比分别为0.65％和0.15％，模型组的分别为14.99％和24.55％，模型+FPS组的分别为2.39％和19.48％。与假手术组比较，模型组和模型+FPS组的胀亡细胞和凋亡细胞的百分比均升高，但模型+FPS组升高幅度较模型组的低，三组间比较差别有显著性(P<0.05)。与假手术组比较，模型组和模型+FPS组的正常细胞的百分比均降低，但模型+FPS组降低幅度较模型组的小，三组间比较差别有显著性(P<0.05)。 4.免疫荧光染色检测结果 假手术组凋亡细胞和胀亡细胞的百分比分别为1.74％和0.59％，模型组的分别为16.36％和16.47％，模型+FPS组的分别为9.95％和8.07％。与假手术组比较，模型组和模型+FPS组的凋亡细胞和胀亡细胞的百分比均升高，但模型+FPS组升高幅度较模型组的小，三组间比较差别有显著性(P<0.05)。 结论： 1.HIRI大鼠肝脏组织存在还原性酶的减少和氧化性物质的增多、肝脏细胞线粒体形态和功能受损、肝脏细胞发生凋亡和胀亡的现象。 2.预防性使用附子多糖是通过抑制HIRI大鼠氧化应激作用、减轻线粒体形态和功能损害、减少肝脏细胞凋亡、胀亡发生的百分比而产生保护作用。 创新点： 1.本实验发现了大鼠HIRI过程中不仅存在着细胞凋亡，还发生了细胞胀亡。首次证明HIRI过程中有着细胞凋亡过度评价的现象。 2.本实验首次以不同的给药时间和给药剂量预防性使用附子多糖，证明了它对HIRI大鼠有保护效果。 3.从抗氧化应激—线粒体—细胞凋亡/胀亡的角度出发，探讨了附子多糖对HIRI大鼠产生保护作用的机制。