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目的探讨通过尾静脉注射人脐带间充质干细胞外泌体对阿霉素诱导扩张型心肌病大鼠模型的心肌纤维化的缓解作用及对心脏功能的改善作用。方法1.构建扩心病大鼠模型并评估其心脏功能购买体重均匀且日龄在42天左右的雄性SD(Sprague Dawley)大鼠100只,采用随机的方法选出20只作为正常组大鼠,剩余80只作为扩张型心肌病(Dilated cardiomyopathy,DCM)组大鼠。构建DCM大鼠模型采用的是腹腔注射阿霉素1.0mg/kg/次,2次/周,持续注射8周。正常组大鼠同期以相同途径注射根据体重注射相应剂量的生理盐水,以形成对照。阿霉素注射8周,观察1周后,行超声心动图检测评估各组大鼠心功能情况。2.人脐带间充质干细胞(human umbilical mesenchymal stem cells-derived exosome,hUCMSCs-Ex)外泌体的提纯与鉴定运用组织块贴壁法培养原代人脐带间充质干细胞(human umbilical mesenchymal stem cells,hUCMSCs),待其稳定生长3代后采用流式细胞术,对干细胞表面特异性标志物CD90,CD146,HLA-DR进行鉴定;收集第4代且采用不含外泌体的培养基培养的hUCMSCs的细胞上清,超高速离心法提取外泌体(exosomes);应用透射电子显微镜观察外泌体浓缩液中的外泌体形态;采用免疫蛋白印记的方法(Western blot)测定hUCMSCs-Ex的表面特异性蛋白质CD81及CD9蛋白分子;纳米颗粒跟踪分析技术(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)对提取的外泌体颗粒进行追踪分析。3.尾静脉注射hUCMSCs-Ex对DCM大鼠心肌纤维化及心功能的影响将用阿霉素成功造模的DCM组大鼠采用随机分组法分成4组:hUCMSCs-Ex低剂量组(n=17)、中剂量组(n=17)及高剂量组(n=17)和DCM对照组(n=17)。分别通过大鼠尾静脉注射hUCMSCs-Ex 20μg/kg、100μg/kg、250μg/kg和1ml/kg的PBS,1次/周,持续28d。正常组大鼠同期注射1ml/kg PBS。药物注射结束后观察1周,心脏超声评估大鼠心脏功能,选取的检测时间分别在hUCMSCs-Ex治疗前、hUCMSCs-Ex治疗结束1周后。治疗结束1周后处死全部大鼠,取大鼠心肌组织,实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测大鼠心肌组织的SMADS家族(Smad2),Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)及ɑ平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA水平;Western blot检测大鼠心肌组织的Smad2,COLⅠ及α-SMA蛋白表达水平;同时行心肌组织HE和Masson染色。结果1.DCM大鼠模型建立在阿霉素注射过程中正常组大鼠一般情况并无变化。DCM组大鼠在注射过程中出现心脏衰竭的表现,并且随着注射时间的延长呈进行性严重的趋势,逐渐出现进食量减少、腹胀腹水、呕吐、便血的情况。阿霉素注射结束后,超声心动图显示DCM组大鼠室壁广泛性活动度下降,左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)较正常对照组大鼠显著增加(P<0.01),反应心脏射血功能的左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)数据较正常对照组大鼠明显下降(P<0.01)。2.hUCMSCs及其hUCMSCs-Ex的鉴定选取生长稳定的第4代hUCMSCs,光学显微镜下观察hUCMSCs呈边缘清晰且明亮的长梭形或多边形贴壁生长,流式细胞术检测结果显示hUCMSCs表面特异性蛋白分子CD90呈高表达状态,CD146、HLA-DR呈低表达状态;透射电子显微镜可观察到hUCMSCs-Ex为规则的椭圆形态的泡状结构;Western blot方法发现外泌体表达特异性CD81及CD9蛋白分子;采用纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)追踪分析外泌体浓缩液发现外泌体微粒直径集中在100-150nm之间居多。3.尾静脉注射hUCMSCs-Ex对DCM大鼠心肌纤维化及心功能的影响hUCMSCs-Ex治疗后明显提升了大鼠的存活率,其心脏衰竭的症状如胸水、腹水等都较DCM对照组有显著改善;hUCMSCs-Ex治疗28d后,LVFS、LVEF较治疗前及DCM对照组均有明显的提升(P<0.05);RT-PCR检测显示hUCMSCs-Ex治疗后Smad2,COLⅠ及α-SMA的m RNA水平显著下降;Western blot检测显示hUCMSCs-Ex治疗后,大鼠心肌组织纤维化相关指标Smad2,COLⅠ及α-SMA蛋白表达显著降低;Masson染色显示,较正常组大鼠,DCM对照组大鼠心肌组织心肌组织内出现较多的蓝染的胶原蛋白组织,较DCM对照组,hUCMSCs-Ex治疗后大鼠心肌组织胶原蛋白显著降低;HE染色显示,DCM对照组大鼠心肌纤维排列紊乱,可观察到断裂的心肌纤维,同时能观察到水肿的心肌细胞及间质,大量坏死的炎症细胞呈灶状聚集,较DCM对照组,hUCMSCs-Ex治疗后大鼠发现上述损伤明显降低。结论1.采用分次分剂量腹腔注射阿霉素药物的途径,能够建立病理机制与临床扩心病相同的扩张型心肌病大鼠模型。2.采用大鼠尾部静脉注射hUCMSCs-Ex的方式可以减轻扩张型心肌病大鼠心肌纤维化的水平,提高了扩张型心肌病大鼠异常的心脏功能。验证了干细胞的旁分泌机制。