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目的:随着纳米技术的进步,纳米材料已深入人们生活的方方面面中,例如含有纳米材料的化妆品、涂料、纺织品、医用敷料、医用成像造影剂和生物制剂等。人们通过呼吸道、消化道、皮肤和静脉注射等方式直接或间接地暴露于环境中纳米材料,可能会导致潜在的公共健康问题,比如肝、肾等脏器的病变和损伤。但是目前的研究尚不能全面阐释纳米材料的生物学效应及毒作用机制,同时医用纳米材料的作用靶点及分子机制也尚未完全阐明。大量文献报道纳米材料进入细胞后会诱导线粒体和内质网功能的紊乱。线粒体电子传递链(mitochondrial electron transmission chain,METC)是线粒体合成ATP的基本组成部分,其受到损伤会诱导细胞活性氧(ROS)的升高,ATP合成受阻,从而影响细胞稳态平衡的破坏。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是内质网对细胞内外因素刺激的应答反应;已有报道纳米材料进入细胞后有可能导致内质网内未折叠或错误折叠蛋白堆积,引发ERS。因此,本研究通过探讨超顺磁氧化铁纳米颗粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIO-NPs 或 SPIONs)和碲化镉量子点(cadmium telluride quantum dots,CdTe-QDs)两种典型的医用纳米材料作用于细胞线粒体和内质网介导肝、肾功能生物学效应,阐明纳米材料诱导METC损伤和ERS的作用,为医用纳米材料的开发设计与安全性评价提供理论依据,推动医用纳米材料更快、更安全地应用于医学诊断、基因治疗和细胞标记等领域。方法:1.SPIONs靶向细胞METC诱导肝细胞反应性和肝癌细胞抗肿瘤效应的研究:采用不同浓度SPIONs处理癌细胞系(包括人肝癌HepG2细胞和QGY-7703细胞,小鼠神经瘤母细胞N2a)和正常细胞系(包括人正常肝细胞QSG-7701、小鼠巨噬细胞Raw264.7和小鼠成纤维细胞NIH3T3)12h后检测相关指标。(1)透射电子显微镜(TEM)与动态光栅(DLS)检测SPIONs的形态、粒径大小和Zeta电位;(2)MTS颜色反应法检测各处理组细胞存活率;(3)普鲁士蓝染色及石墨炉原子吸收光谱法(GF-AAS)检测不同细胞对SPIONs摄取量;(4)TEM观察SPIONs在细胞内的分布及细胞器形态的改变;(5)检测线粒体ATP合成、线粒体膜电位的改变、Ca2+和细胞色素c分布综合评价纳米材料对线粒体功能的影响;(6)SPIONs诱导HepG2和QSG-7701细胞凋亡水平的差异;(7)检测细胞谷胱甘肽(GSH)的含量,比较癌细胞和正常细胞抗氧化能力,并加入外源性GSH验证;(8)检测细胞线粒体ROS含量的改变,评价细胞线粒体氧化应激水平;并给予外源性加入线粒体ROS特异性抑制剂MitoTempo和广谱ROS抑制剂NAC进行验证;(9)应用全基因组表达芯片(DNA microarray)检测SPIONs诱导的HepG2细胞差异表达的基因(DEGs),再利用生物信息学方法分析差异基因所涉及的分子功能(MF)、生物过程和信号通路(BP),并通过qRT-PCR进行相关基因验证。2.CdTe-QDs诱导肾细胞ERS介导自噬的生物学效应相关研究:CdTe-QDs处理人胚肾(HEK)细胞12h,以CdC12和Na2Te03处理为对照,进行体外实验;给予8～10周龄,体重25～30 g的雄性BALB/C小鼠尾静脉注射8、16 nmol/kg体重的CdTe-QDs暴露24 h,建立动物CdTe-QDs暴露模型进行体内实验。材料表征方法:紫外-可见光光谱法、高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)和动态光散射(DLS)法进行CdTe-QDs材料表征。细胞模型中检测指标:(1)MTS、CCK-8和LDH释放实验检测各处理组HEK细胞存活率;(2)激光共聚焦显微镜和TEM观察CdTe-QDs在细胞内的分布;(3)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western Blot)、激光共聚焦显微镜检测CdTe-QDs处理组HEK细胞ER应激和自噬的发生;(4)溶酶体抑制剂氯喹(CQ)验证自噬流的发生,ERS抑制剂4-PBA及GRP78小干扰RNA(siGRP78)干预验证ERS和自噬的调控关系;(5)建立不同入胞方式抑制模型,探讨HEK细胞对CdTe-QDs的摄取方式;(6)利用已构建的HEK报告基因(HEK-SEAP)细胞,应用于不同纳米材料诱导ERS的检测、验证与评价。动物模型检测指标:(1)HE染色观察肾脏组织形态改变;(2)血清和全血肾功能生化指标;(3)GF-AAS检测主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)、尿液、粪便及血液中Cd元素含量;(4)小动物活体成像系统检测CdTe-QDs在小鼠体内主要器官的分布;(5)Western Blot和qRT-PCR检测ERS及自噬相关的蛋白和mRNA水平;(6)IHC观察肾脏组织ERS及自噬相关蛋白的表达及分布。结果:1.SPIONs对癌细胞和正常细胞线粒体产生不同的影响,诱导的生物效应存在差异,研究发现:(1)SPIONs在培养基中的粒径接近97 nm,Zeta电位为28.4 ±5.7 nm;(2)15、20 μg/mL的SPIONs诱导癌细胞存活率显著性降低,而对正常细胞存活率无显著影响;(3)不同癌细胞和正常细胞对SPIONs摄取量无显著性差异;(4)TEM结果显示细胞摄取SPIONs在细胞质和细胞核中均有分布,且在癌细胞中线粒体形态发生肿胀和断裂等现象;(5)SPIONs导致肝癌HepG2细胞ATP合成量降低、线粒体膜电位(MMP)下降、Ca2+分布紊乱及细胞色素c释放进入胞质,而对正常肝细胞QSG-7701的线粒体功能无显著影响;(6)SPIONs诱导HepG2细胞中Bcl-2蛋白的降低、Bax蛋白升高,同时caspase 3剪切体蛋白升高,说明线粒体依赖性凋亡通路被激活;但是SPIONs并没有影响QSG-7701细胞中线粒体依赖性凋亡相关蛋白水平;(7)SPIONs诱导HepG2细胞GSH含量降低,给予外源GSH可以部分挽救细胞存活率;但是SPIONs对QSG-7701细胞GSH含量没有显著性改变;(8)SPIONs诱导HepG2细胞线粒体ROS产生增多,给予ROS清除剂NAC和MitoTempo能够降低线粒体ROS,减少caspase 3剪切体蛋白含量,降低线粒体依赖性凋亡;(9)DNA microarray检测和生物信息学分析结果显示SPIONs诱导HepG2细胞的DEGs,涉及到分子功能主要是金属离子结合功能,而涉及的BP主要有METC等过程;挑选代表性DEGs进行qRT-PCR验证,趋势与DNA microarray结果相符。2.CdTe-QDs通过诱导肾细胞ERS的发生调控自噬。CdTe-QDs材料表征可见:紫外-可见光吸收光谱的波峰在552 nm,紫外激发的发射波长为525 nm,HRTEM显示的粒径为4.08 nm。体外实验结果可见:(1)相同摩尔浓度的CdTe-QDs比CdC12和Na2TeO3对HEK细胞具有更大的细胞毒性;(2)激光共聚焦显微镜观察到CdTe-QDs与内质网、线粒体和溶酶体分布共定位;(3)CdTe-QDs诱导HEK细胞ERS相关标志GRP78和ATF4蛋白和相应mRNA水平升高,同时自噬负调控蛋白p-AKT和p-mTOR表达量降低,自噬标志分子p62和LC3-Ⅱ蛋白升高,提示mTOR信号通路被抑制、自噬被激活,表明CdTe-QDs诱导HEK细胞ERS和自噬的发生;(4)CQ可抑制自噬体与溶酶体的融合,加入CQ后LC3增强更加明显,说明CdTe-QDs诱导了 HEK细胞自噬流的形成;CdTe-QDs诱导GRP78、ATF4及LC3-II表达升高,在给予4-PBA或者siGRP78处理可抑制ERS相关蛋白GRP78和ATF4表达,同时LC3-II蛋白表达降低,说明ERS调控自噬发生;(5)HEK细胞摄取CdTe-QDs后细胞中Cd含量高于CdC12处理组,且CdTe-QDs在模拟溶酶体酸性环境下释放Cd2+;(6)采用HEK-SEAP报告基因细胞,筛查发现CdTe-QDs和ZnO-NPs能够激活细胞ERS发生,利用WB和MTS验证ERS相关蛋白表达升高同时未见细胞活力降低,说明HEK-SEAP报告基因系统能用于快速、准确地初步筛查纳米材料诱导细胞ERS 水平。体内实验结果可见:(1)HE染色未见小鼠肾脏组织形态学的改变;(2)肾功能指标显示,尿酸(UA)随着CdTe-QDs剂量增加而降低,肌酐(CREA)和尿素氮/肌酐比(BUN/CREA)在高剂量组显著升高,提示急性静脉暴露CdTe-QDs可导致小鼠急性肾功能紊乱。CdTe-QDs对小鼠红细胞数目(RBC)及血红蛋白(Hb)的含量没有显著影响,但高剂量组引起了白细胞数目(WBC)增高和血小板(PLT)含量降低,提示高剂量CdTe-QDs暴露可引起小鼠急性炎症反应;(3)GF-AAS结果显示,肝脏和肾脏组织中Cd元素含量最高,小动物荧光成像系统观察到小鼠肝脏和肾脏荧光值最强,提示急性暴露后在肝、肾中的分布;(4)CdTe-QDs诱导小鼠肾脏组织ERS和自噬相关的蛋白和mRNA 水平升高;(5)IHC也观察到小鼠肾脏组织ERS和自噬相关蛋白表达增高。结论:1.本研究阐释了 SPIONs通过选择性靶向癌细胞METC调控细胞凋亡的机制,为METC作为新的纳米材料抗癌靶点的潜在应用和安全性评估提供新的思路和方向。2.体内、外实验阐明了 CdTe-QDs通过诱导肾细胞ERS介导调控细胞自噬的机制,为医用纳米材料的开发设计与安全性评价提供理论依据。3.以ERS为靶点构建的HEK-SEAP报告基因体系能够初步应用于纳米材料诱导肾细胞ERS发生的评价,为ERS作为早期生物标志应用于纳米材料安全性评价提供一种策略。